兩種方法提取佛手渣多糖及其對巨噬細胞RAW264.7免疫調節活性的研究

,3,*,3

(1.華南農業大學食品學院,廣東廣州 510642;2.廣東展翠食品股份有限公司,廣東潮州 515634;3.廣東省功能食品活性物重點實驗室,廣東廣州 510642)

佛手(CitrusmedicaL.var.sarcodactylisSwingle)為蕓香科香櫞屬植物佛手的果實,又名佛手柑、香櫞、蜜羅柑、福壽橘,具有疏肝理氣、和胃止痛、生津化痰的功效,可治療肝胃氣滯、胸悶脹痛、食少嘔吐、咳嗽痰多等癥,是我國名貴的傳統中藥材[1]。佛手含有揮發油、香豆素、黃酮、氨基酸、礦物質和多糖等多種活性成分,隨著佛手化學成分、藥理作用等研究的不斷深入,其抗癌、抗氧化、免疫調節等作用也逐漸被大眾熟知[2-3]。據文獻報道,佛手含有總糖8. 01%[4],而廣佛手的多糖含量平均為5.56%[5]。目前關于佛手多糖的提取方法有熱水提取法[6-12]、堿提法[13]、超聲輔助提取法[14]、復合酶提取法[15]等,這些方法都存在耗時長、溶劑消耗大、操作不便等缺點,不適合大規模工業化連續性生產。連續相變萃取法(Continuous phase-transition extraction,CPE)是本課題組自主研發的一種新型高效萃取方法[16]。它是在超臨界、亞臨界萃取技術的基礎上,在密閉環境中控制壓力對物料進行連續的逆流萃取,無溶劑殘留,溶劑重復回收率高,無需過濾即可分離漿渣,且在密閉系統進行萃取,不會造成環境污染[17-18]。目前CPE法已廣泛應用于提取油脂類物質[17-21]和膳食纖維[22],而用于提取多糖則尚未見報道。

近年來,植物多糖的研究備受關注,大量研究結果表明植物多糖對小鼠巨噬細胞RAW264.7具有良好的免疫調節作用[23-28]。巨噬細胞是天然免疫系統中最重要的免疫細胞之一,是衰老細胞、病原體和癌細胞的第一效應細胞,其活化被認為是免疫系統刺激的主要和必要步驟[29]。巨噬細胞表面具有多種受體,與植物多糖結合后可轉變為活化的巨噬細胞,產生如一氧化氮(nitticoxide,NO)等活性細胞因子,參與細胞內炎癥反應過程,清除相關病原體,從而發揮免疫調節作用[30]。但目前關于佛手多糖免疫活性的研究鮮見報道。基于上述分析,本文以CPE法提取精油和黃酮后的佛手渣作為原料,分別采用CPE法和熱水浸提法(Hot water extraction,HWE)提取佛手多糖,比較兩種提取方法的得率和提取率;并以RAW264.7巨噬細胞為模型,初步探究由兩種方法提取并經醇沉和脫除蛋白質的佛手多糖的體外免疫活性,為佛手資源的綜合開發利用及佛手多糖產品研發提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

廣佛手干片 廣東展翠食品股份有限公司提供;小鼠腹腔RAW264.7巨噬細胞 中國科學院干細胞庫提供;DMEM高糖培養基 賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司;PBS緩沖液(pH7.4) 賽默飛世爾(蘇州)儀器有限公司;四季青胎牛血清 浙江天杭生物科技股份有限公司;青-鏈霉素溶液 美國Gibco公司;噻唑藍(MTT)、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS) 美國Sigma公司;中性紅 美侖生物;NO試劑盒 上海碧云天生物技術有限公司;其它試劑均為市售分析純。

連續相變萃取裝置 本課題組自主研發;BJ-400A中草藥萬能粉碎機 浙江溫嶺市藥材機械廠;DF-101S型數顯電熱恒溫水浴鍋 鞏義予華儀器有限公司;UV-3010型紫外分光光度計 日本日立高科技公司;AL104型萬分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;Enspire 2003型多功能酶標儀 美國PerkinElmer公司;BDS 200倒置生物顯微鏡 重慶奧特光學儀器有限責任公司;CCL-170B-8 CO2培養箱 新加坡藝思高(ESCO)科技有限公司;Airstream? A2型二級生物安全柜 新加坡藝思高(ESCO)科技有限公司。

圖1 連續相變萃取裝置構造示意圖Fig.1 Structure diagram of continuousphase-transition extraction device注：S1:過濾器；S2：高壓泵；S3：流量計；S4：真空泵；S5：乙醇；S6：丁烷；Vi(i=1,2,3 to 9):閥門；Pi(i=1,2,3 to 6):壓力表；K1、K3：熱交換器；K2：萃取釜；K4、K8：解析釜；K5、K9：蒸餾塔；K6、K10：冷凝器；K7、K11：蓄液罐。

1.2 實驗方法

1.2.1 佛手干片預處理 將廣佛手干片粉碎后過30目篩,經過CPE法依次提取佛手精油[31]和黃酮后[32],得到的佛手渣在55 ℃烘箱進行干燥,儲藏于4 ℃,備用。

1.2.2 提取流程

1.2.2.1 CPE法 稱取一定量的佛手渣于萃取釜中,以蒸餾水為溶劑,在0.2～0.4 MPa壓力下,設置萃取溫度為80～100 ℃,萃取流速50～70 L/h,連續萃取3.0～5.0 h,萃取得到的佛手多糖提取液進入解析釜中,解析溫度與萃取溫度一致,通過加熱減壓使萃取劑相變為氣體,再通過及時壓縮變為液體儲存在溶劑罐中,溶劑通過管道流回萃取釜,對物料再次進行加壓萃取,如此往復循環,無需過濾即可實現漿渣分離得到佛手多糖粗提液。

1.2.2.2 HWE法 稱取一定量的佛手渣于燒杯中,以蒸餾水為溶劑,設置萃取溫度為85～95 ℃,液料比為50～70 mL/g,連續萃取2.0～3.0 h,過濾收集上清液,向濾渣加入相同比例的溶劑再次萃取相同時間,過濾后合并兩次濾液即得佛手多糖粗提液。

1.2.3 響應面優化佛手多糖提取工藝 根據前期的單因素實驗結果,在0.2～0.4 MPa壓力下,選擇A溫度(℃)、B時間(h)、C流速(L/h)三個因素為CPE法的自變量,選擇A溫度(℃)、B時間(h)、C液料比(mL/g)三個因素為HWE法的自變量,以佛手多糖提取率為響應值,采用Box-Behnken中心組合設計進行響應面優化。各因素的編碼值與真實值見表1。

表1 Box-Benhnken設計試驗因素水平表Table 1 Factor and level of Box-benhnken design test

1.2.4 佛手多糖純化 將得到的佛手多糖粗提液濃縮至原體積的1/8,加入四倍體積的無水乙醇,在4 ℃條件下靜置沉淀24 h,過濾后脫水干燥得到醇沉多糖,再采用Sevag法[33]脫除醇沉多糖中的蛋白質,冷凍干燥即得到佛手多糖(CPE法提取的醇沉多糖CCP、脫蛋白多糖CDP和HWE法提取的醇沉多糖HCP、脫蛋白多糖HDP)。參照He等[34]的方法,以葡萄糖為標準品,采用苯酚-硫酸法測定佛手多糖含量,根據線性回歸方程計算佛手多糖提取率,根據凍干后的樣品質量計算得率:

佛手多糖提取率(%)=C×F×V/M×100

式(1)

佛手多糖得率(%)=m/M×100

式(2)

式中(1)、(2)中:C為佛手多糖溶液質量濃度,g/mL;F表示佛手多糖溶液稀釋倍數;V表示佛手多糖溶液體積,mL;M表示佛手渣質量,g;m表示凍干后得到的佛手多糖質量,g。

1.2.5 佛手多糖對巨噬細胞RAW264.7的免疫調節作用

1.2.5.1 MTT法檢測巨噬細胞的增殖作用 取對數生長期的RAW264.7細胞,調整細胞濃度為1×105個/mL,按照每孔200 μL加入96孔細胞培養板中,在37 ℃,5% CO2條件下培養24 h。棄去培養基,分別加入200 μL含有不同濃度(10、25、50、100、250、500、800、1000 μg/mL)佛手多糖(CCP、CDP、HCP、HDP)的DMEM完全培養基,每組設置6個復孔。培養24 h后,棄去上清液,每孔加入50 μL 1 mg/mL的MTT溶液,于37 ℃繼續培養4 h,棄去上清液,每孔加入150 μL DMSO溶液,震蕩混勻后測定490 nm處吸光值A。細胞增殖率(%)=(實驗組A值/對照組A值)×100。

1.2.5.2 佛手多糖對巨噬細胞NO分泌的影響 取對數生長期的RAW264.7細胞,按4×104個/孔加入96孔細胞培養板中培養24 h,每孔200 μL。分別加入200 μL含有不同濃度(5、10、25、50、100、200、250、500 μg/mL)佛手多糖(CCP、CDP、HCP、HDP)的DMEM完全培養基,空白對照和陽性對照組分別加入等體積的DMEM完全培養基和2 μg/mL LPS,每組設置6個復孔,置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。24 h 后取50 μL細胞培養上清液,與等體積的Griess試劑混合,避光反應10 min,在酶標儀上測定540 nm處吸收值,并根據標準曲線計算NO分泌量。

1.2.5.3 中性紅實驗檢測巨噬細胞吞噬活性 取對數生長期的RAW264.7細胞,按4×104個/孔加入96孔細胞培養板中培養24 h,每孔200 μL。棄去上清液,分別加入200 μL含有不同濃度(5、10、25、50、100、200、250、500 μg/mL)佛手多糖(CCP、CDP、HCP、HDP)的DMEM完全培養基,空白對照和陽性對照組分別加入等體積的DMEM完全培養基和2 μg/mL LPS,每組設置6個復孔,置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。24 h后棄去上清液,各孔分別加入50 μL含有0.05%中性紅PBS溶液,繼續培養4 h。棄去上清液,用PBS洗3遍,每孔加入細胞裂解液(乙醇∶冰醋酸=1∶1)100 μL,室溫下放置2 h,待細胞溶解后,在酶標儀上測定540 nm處吸光值A。細胞吞噬率(%)=(實驗組A值/對照組A值)×100。

1.3 數據處理與分析

所有實驗均重復3次,實驗數據以均值±標準差來表示;采用SPSS 17.0進行單因素方差分析,利用Origin 9.0和Design-Expert 8.0.6軟件分別對實驗結果進行作圖與響應面分析。

2 結果與分析

2.1 CPE法提取佛手多糖響應面工藝優化

2.1.1 CPE法回歸模型的建立與方差分析 根據單因素實驗結果,以佛手多糖提取率(Y)為響應值,將溫度、時間和流速三個因素進行Box-Behnken中心組合設計響應面優化,其結果見表2所示。

表2 CPE法Box-Benhnken試驗設計及結果Table 2 Box-Benhnken experimental design arrangementand experimental results of CPE method

試驗結果采用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件對表2中17個試驗點的響應值進行多元回歸擬合得到佛手多糖提取率與溫度(A)、時間(B)和流速(C)各因素的二次多項回歸方程模型Y1:

Y1=14.74+2.54A+0.49B+0.11C-0.13AB+0.96AC+0.57BC-1.77A2-0.72B2-1.00C2對模型進行顯著性檢驗,由回歸模型的方差分析表3可以看出,CPE法提取佛手多糖的提取率整體模型的F為9.43(P<0.01),因此,模型因子具有極顯著性意義。該模型的失擬項F為6.19(P>0.05),無顯著性差異,說明這種試驗方法是可靠的,模型能夠很好的推測試驗結果。表3中,CPE法提取佛手多糖的提取率模型決定系數R2為0.9238,說明該模型擬合程度良好,試驗誤差小;校正擬合度R2Adj為0.8258,說明模型可以解釋82.58%響應值的變化。變異系數CV為7.42%,CV反映模型的置信度,CV值越低,模型的置信度越高[35]。信噪比(Adeq Precision)為9.379,信噪比大于4為理想值,說明模型有著較好的信噪比,試驗穩定性比較高,模型方程能夠較好地反映真實的試驗值[36]。因此,可以用該回歸方程模型來解釋CPE法提取佛手多糖設計方案。

表3 CPE法回歸模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation of CPE method

表3中F值越大表明該因素對佛手多糖提取率影響越顯著,各因素對多糖提取率的影響大小依次為:溫度(A)>時間(B)>流速(C)。在此模型中A和A2是極顯著性因子項(P<0.01),而B、C、AB、AC、BC、B2、C2無顯著性差異(P>0.05),說明提取溫度、時間、流速兩兩間交互作用不顯著。

2.1.2 CPE法最佳工藝條件的確定及驗證試驗 通過Design-Expert 8.0.6軟件求解方程,系統預測得出CPE法提取佛手多糖的最佳工藝條件為:溫度98.62 ℃,時間4.5 h,流速66.09 L/h,模型預測的佛手多糖提取率為15.99%。考慮到實際操作因素,將上述優化條件修正為:溫度99 ℃,時間4.5 h,流速66 L/h。經過試驗驗證得出,在此條件下佛手多糖的提取率為16.09%,與模型預測值僅相差0.10%。因此,響應面法優化CPE法提取佛手多糖是可行的,得到的多糖提取條件具有實際應用價值。

2.2 HWE法提取佛手多糖響應面工藝優化

2.2.1 HWE法回歸模型的建立與方差分析 根據單因素實驗結果,以佛手多糖提取率(Y)為響應值,將提取溫度、時間和液料比三個因素進行Box-Behnken中心組合設計響應面優化,其結果見表4所示。

表4 HWE法Box-Benhnken試驗設計及結果Table 4 Box-Benhnken experimental design arrangementand experimental results of HWE method

試驗結果采用Design-Expert.V 8.0.6.1軟件對表4中17個試驗點的響應值進行多元回歸擬合得到佛手多糖提取率與提取溫度(A)、時間(B)和液料比(C)各因素的二次多項回歸方程模型Y2:

Y2=12.75+1.65A+0.94B-0.028C+0.14AB-0.022AC+0.088BC-0.25A2+0.37B2-0.097C2

對模型進行顯著性檢驗,由回歸模型的方差分析表5可以看出,HWE法提取佛手多糖的提取率整體模型的F為14.50(P<0.01),因此,模型因子具有極顯著性意義。該模型的失擬項F為2.79(P>0.05),無顯著性差異,說明這種試驗方法是可靠的,模型能夠很好的推測試驗結果。佛手多糖提取率模型的決定系數R2為0.9491,說明該模型擬合程度良好,試驗誤差小;校正擬合度R2Adj為0.8836,說明模型可以解釋88.36%響應值的變化。變異系數CV為3.75%,說明模型有著較高的置信度,表明該實驗具有很高的精確度和良好的可靠性。信噪比(Adeq Precision)為14.120,說明實驗穩定性高,模型方程可以很好反映試驗值的真實性。因此,可以用該回歸方程模型來解釋HWE法提取佛手多糖設計方案。

表5 HWE法回歸方程方差分析Table 5 Variance analysis of regression equation of HWE method

由表5分析結果可知,各因素對多糖提取率的影響大小依次為:溫度(A)>時間(B)>液料比(C)。在此模型中A和B是極顯著性因子項(P<0.01),而C、AB、AC、BC、A2、B2、C2無顯著性差異(P>0.05),說明提取溫度、提取時間、液料比兩兩間交互作用不顯著。

2.2.2 HWE法最佳工藝條件的確定及驗證試驗 通過Design-Expert 8.0.6軟件求解方程,系統預測得出HWE法提取佛手多糖的最佳工藝條件為:溫度95 ℃,時間3.0 h,液料比63.20 mL/g,提取2次，模型預測的佛手多糖提取率為15.62%。考慮到實際操作因素,將上述優化條件修正為:溫度95 ℃,時間3.0 h,液料比63 mL/g，提取2次。經過試驗驗證得出,在此條件下佛手多糖的提取率為15.43%,與模型預測值僅相差0.19%。因此,響應面法優化HWE法提取佛手多糖是可行的,得到的多糖提取條件具有實際應用價值。

2.3 兩種提取方法比較

圖2 佛手多糖對RAW264.7細胞增殖的影響Fig.2 The effect of bergamot polysaccharide on the proliferation of RAW264.7 cells注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),圖3、圖4同。

從表6可知,CPE法在0.20～0.4 MPa的壓力下對佛手多糖進行提取,提取溫度比HWE法高,提取4.5 h后的提取率和得率都顯著高于提取了6.0 h的HWE法(P<0.05)。陳孝云等[37]分別采用傳統水提法、超聲輔助法、微波輔助法、超聲-微波協同提取法和復合酶法提取佛手多糖,其提取率均低于本文所采用的CPE法。這可能是因為天然植物的細胞壁在一定程度上會阻礙胞內多糖的釋放,CPE法提取時會增加一定的壓力,使細胞內外形成壓力差,增強細胞的破壁作用,胞內多糖得到釋放并溶于提取溶劑中,從而完成目標成分的提取[38]。而HWE法和其他方法是在常壓下進行的,細胞壁的阻擋使得多糖的釋放減少,故提取率比CPE法低。綜合比較,CPE法的提取時間遠少于HWE法,且操作簡單、無需過濾,提取率和得率高,是一種高效的提取方法。

表6 CPE法與HWE法對比Table 6 Comparison between CPE method and HWE method

2.4 佛手多糖免疫調節活性研究

2.4.1 佛手多糖對RAW264.7細胞增殖的影響 采用MTT法檢測細胞活性,不同濃度的佛手多糖對巨噬細胞的增殖活性結果如圖2所示。從圖2(a)中可看出,RAW264.7細胞的存活率隨CCP濃度的增高而下降,具有劑量依賴作用,在10 μg/mL存活率(85.76%)最高,而當濃度高于500 μg/mL時,CCP則顯著抑制了細胞的增殖(P<0.05);圖2(b)中,CDP濃度對RAW264.7細胞的增殖作用大致呈現先上升后下降的“鐘罩型”,存活率均大于81%,在濃度50～500 μg/mL時存活率大于95%,對RAW264.7細胞無明顯損傷,在500 μg/mL濃度有最高存活率為99.4%;圖2(c)中,HCP濃度為10～250 μg/mL時顯著促進RAW264.7細胞的增殖活性,尤其是在10 μg/mL濃度時的促增殖能力最高(P<0.05),HCP濃度高于500 μg/mL時,RAW264.7細胞的促增殖能力隨濃度增大而下降,在1000 μg/mL時的存活率低于80%(P<0.05);圖2(d)中,HDP濃度對RAW264.7細胞的促增殖能力呈先下降后上升的波浪形趨勢,RAW264.7細胞的存活率均大于96%,對RAW264.7細胞無明顯毒性,在濃度為800 μg/mL時細胞存活率(144.09%)最高。綜合考慮,低于500 μg/mL的佛手多糖濃度對RAW264.7細胞毒性較小,不會影響其增殖活性,選擇0～500 μg/mL的佛手多糖濃度進行后續實驗。

圖3 佛手多糖對RAW264.7細胞NO分泌的影響Fig.3 The effect of bergamot polysaccharide on NO secretion of RAW264.7 cells

圖4 佛手多糖對RAW264.7細胞吞噬活性的影響Fig.4 The effect of bergamot polysaccharide on phagocytosis activity of RAW264.7 cells

2.4.2 佛手多糖對RAW264.7細胞NO分泌量的影響 NO是一種重要的炎癥介質,活化巨噬細胞可合成NO,參與細胞凋亡的調節和宿主對病原體或外來物質的防御;同時,NO也能促進巨噬細胞的溶解和吞噬[39]。由圖3可知,四種多糖組分(CCP、CDP、HCP和HDP)均能提高RAW264.7細胞NO釋放量。從圖3(a)中可看出,CCP在濃度10～250 μg/mL范圍內NO釋放量無顯著性差異(P>0.05),而在最高濃度500 μg/mL時,NO釋放量(10.69 μmol/L)達到最大,顯著高于空白對照組(0.35 μmol/L)和LPS陽性對照組(5.22 μmol/L)以及中低劑量組(P<0.05);圖3(b)～(c)中,CDP和HCP濃度對RAW264.7細胞NO釋放量具有劑量依賴性,NO釋放量大致均隨CDP和HCP濃度升高而升高,在25～500 μg/mL范圍內的NO分泌量顯著高于對照組和低劑量組(5～10 μg/mL)(P<0.05),CDP在200 μg/mL時有最大NO釋放量(12.78 μmol/L),與LPS陽性對照組(13.33 μmol/L)無顯著性差異(P>0.05),而HCP在濃度250 μg/mL時的NO分泌量為14.02 μmol/L,與LPS刺激組(13.19 μmol/L)無顯著性差異(P>0.05),表明CDP和HCP都可以促進RAW264.7細胞NO的分泌,均具有良好的免疫活性;圖3(d)中,HDP對應的NO釋放量呈低濃度促進、高濃度抑制的“鐘罩型”劑量依賴關系,與空白對照組、LPS陽性對照組和高劑量組(250～500 μg/mL)相比,中低劑量組(10～200 μg/mL)顯著促進RAW264.7細胞分泌NO(P<0.05),在50 μg/mL時NO分泌量達到11.84 μmol/L,表明HDP也具有良好的免疫活性。與空白對照組相比,CCP、CDP、HCP和HDP在各自最佳有效濃度促進RAW264.7細胞釋放NO能力分別提高了29.54、16.06、16.10和11.87倍,說明佛手多糖具有一定的免疫活性作用,與Peng等的報道一致[40]。

2.4.3 佛手多糖對RAW264.7細胞吞噬活性的影響 吞噬作用是巨噬細胞對病原體和癌細胞反應的主要特征之一[41]。測定活化巨噬細胞的吞噬能力可以反映受試樣品對免疫功能的影響。圖4中,CCP、CDP、HCP和HDP四種佛手多糖對RAW264.7細胞的吞噬能力的作用均大致隨濃度上升呈先增加后下降的趨勢,具有劑量依賴性。圖4(a)和(b)中,CCP和CDP均在5 μg/mL時顯著促進RAW264.7細胞吞噬活性(P<0.05),吞噬指數分別為208.00%和145.77%,顯著高于LPS陽性對照組、空白對照組(以100%計,下同)和中高劑量組(P<0.05);圖4(c)和(d)中,HCP和HDP在5～250 μg/mL濃度范圍內可以很好促進RAW264.7細胞吞噬活性,吞噬指數均在100%以上,且兩者分別在50和25 μg/mL時吞噬活性高達224.67%和157.81%,均顯著高于LPS陽性對照組、空白對照組和其它劑量組(P<0.05)。與空白對照組相比,CCP、CDP、HCP和HDP在各自最佳有效濃度促進RAW264.7細胞吞噬作用能力分別提高了1.08、0.46、1.25和0.58倍。與脫除蛋白質的CDP和HDP相比,保留了部分活性蛋白的CCP和HCP促進RAW264.7細胞吞噬作用的能力更好,這可能是與糖蛋白和巨噬細胞表面上的特定受體結合有關[42]。

3 結論

本研究通過CPE和HWE兩種方法提取佛手多糖,經過響應面優化設計得出兩種方法提取佛手多糖的最佳條件為分別為:CPE提取溫度99 ℃,時間4.5 h,流速66 L/h,提取率為16.09%±0.12%,得率21.31%±0.13%;HWE提取溫度95 ℃,時間6.0 h(提取2次，每次3.0 h),液料比63 mL/g,提取率為15.43%±0.21%,得率20.22%±0.16%。與HWE法相比,采用CPE法使佛手多糖提取率提高了4.28%,得率提高了5.39%,并且縮短了1/4提取時間,表明CPE法適用于提取佛手多糖,為其他多糖的提取提供了一定的參考價值。

采用MTT法檢測四種佛手多糖對RAW264.7細胞的毒性作用,結果表明當佛手多糖濃度低于500 μg/mL對細胞沒有明顯毒性;NO釋放量和中性紅吞噬能力的測定結果表明,四種佛手多糖均可促進RAW264.7細胞分泌NO和增加吞噬活性,且促進能力大小分別為CCP>HCP>CDP>HDP,HCP>CCP>HDP>CDP,說明由兩種方法提取且經過醇沉和脫除蛋白質之后得到的四種佛手多糖均具有一定免疫調節活性,為藥食同源的佛手資源深入開發利用和多糖增強免疫類保健食品和藥物的研發提供一定參考。