QuEChERSUPLCMS/MS測定火鍋湯料中6種非法添加化學藥物

劉 俊,吳愛紅,朱 呂,張孝艷,厲晨皓,徐秋生

(平湖市食品藥品檢測中心,浙江嘉興 314200)

火鍋作為一種傳統中國美食,在全國范圍內廣受歡迎,深受大眾喜愛。正因如此,部分商家為了吸引回頭客,謀取私利,使得火鍋湯料成為非法添加的重災區。火鍋湯料的非法添加主要包括罌粟殼生物堿、工業著色染料和頭痛粉三大類[1]。近年來,文獻中很多關于火鍋湯料中罌粟殼生物堿和工業著色染料的測定方法的報道[2-3],2018年4月國家市場監管總局發布的《食品中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的測定》食品補充檢驗方法,闡明了火鍋湯料中嗎啡、可待因、罌粟堿、那可丁和蒂巴因的定量測定。頭痛粉為阿咖酚散的俗稱,是一種解熱鎮痛化學藥品。添加到火鍋湯料中是為了增味提鮮及防治消費者餐后出現腹瀉等身體不適狀況。常用的此類解熱鎮痛類藥物包括對乙酰氨基酚(paracetamol)、氯苯那敏(chlorpheniramine maleate)、雙氯芬酸鈉(diclofenac sodium)、阿司匹林(aspirin)、氨基比林(aminophenazone)和安替比林(antipyrine)等。消費者長期食用含有該類化學藥物的食品會產生不良反應或引起急性肝臟、腎臟毒性,嚴重甚至會造成個體死亡[4-7]。

目前,對乙酰氨基酚、氯苯那敏、雙氯芬酸鈉、阿司匹林、氨基比林和安替比林檢測方法主要有氣相色譜法[8]、高效液相色譜法[9-10]、氣相色譜-質譜法[11]和液相色譜-質譜法等[12-13]。這些方法多以單一組分進行檢測且樣品基質相對簡單,多為血漿、保健品或涼茶等[14-18]。火鍋湯料等高脂肪、高蛋白復雜基質中對乙酰氨基酚、氯苯那敏、雙氯芬酸鈉、阿司匹林、氨基比林和安替比林檢測方法少有報道,國家標準暫未發布權威的檢測方法。因此有必要建立一種快速、準確的檢測方法對火鍋湯料中多種非法添加的化學藥物進行篩查。

分散固相萃取技術QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged and safe)是一種簡單、快捷、準確將目標組分提取與進化的前處理方法[19],已經廣泛應用于蔬菜水果和肉類中農藥、獸藥多殘留的檢測[20-21]。本實驗對火鍋湯料進行QuEChERS提取和凈化,結合超高效液相色譜-串聯質譜法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)建立火鍋湯料中對乙酰氨基酚等6種非法添加化學藥物的分析檢測,該方法簡單、快速、準確。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

6種化學藥物標準品:對乙酰氨基酚(純度99.9%)、馬來酸氯苯那敏(純度99.5%)、雙氯芬酸鈉(純度99.2%)、阿司匹林(純度99.8%)、氨基比林(純度99.5%)和安替比林(純度99.9%) 均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司;甲醇、乙腈 色譜純,美國賽默飛世爾公司;無水硫酸鎂、乙酸鈉 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基硅烷(C18)、石墨化碳黑(GCB)、中性氧化鋁和佛羅里硅土(Florisil) 深圳逗點生物;超純水 實驗室制備;0.22 μm有機微孔濾膜 天津美瑞泰克科技有限公司;30批次火鍋湯料樣品 平湖市8個鄉鎮街道(當湖街道、鐘埭街道、新倉鎮各5批次,曹橋街道、獨山港鎮、新埭鎮、廣陳鎮、林埭鎮各3批次)。

Waters Xevo TQ-S高效液相色譜串聯質譜儀 美國沃特世公司;高速均質器、渦旋振蕩器 德國IKA公司;H1850R高速離心機 湖南湘儀;MS204S電子天平 METTLER TOLEDO(上海)有限公司;Milli-Q Advatantage A10純水儀系統 法國密理博公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制 準確稱取對乙酰氨基酚、氯苯那敏、雙氯芬酸鈉、阿司匹林、氨基比林、安替比林6種化學藥物標準物質各5.0 mg,用甲醇溶解并定容至10 mL,配制成濃度為500 μg/mL的標準儲備液,4 ℃避光儲存。分別吸取0.5 mL對乙酰氨基酚、氯苯那敏、雙氯芬酸鈉、氨基比林、安替比林標準儲備液和5.0 mL阿司匹林標準儲備液至50 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,配制成5.0 μg/mL的混合標準中間液(阿司匹林濃度為50.0 μg/mL)。再用流動相逐級稀釋至1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL的混合標準工作溶液(阿司匹林濃度為10.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1000.0、2000.0 ng/mL)。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為Waters C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm),流動相A:乙腈;流動相B:0.1%甲酸水;流速:0.5 mL/min;進樣量:1 μL;柱溫:40 ℃。梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序Table 1 HPLC gradient elution program

1.2.3 質譜條件 電噴霧離子源,正離子和負離子掃描(ESI+/ESI-);多反應監測(MRM);離子源溫度:150 ℃;脫溶劑溫度:450 ℃;脫溶劑氮氣流速:1000 L/h;毛細管電壓:3 kV。在電噴霧模式下分別對0.5 mg/L、50.0 μg/mL的標準溶液進行全掃描,通過優化離子源、離子管溫度和輔助氣流量等參數使母離子響應達到最優值,并優化得到每個化學藥物的母離子和子離子最佳錐孔電壓和碰撞能量,以多反應監測模式進行掃描,選擇離子信號前兩位分別作為定性或定量離子。具體質譜參數見表2。

表2 6種化學藥物的質譜檢測參數Table 2 Parameters for mass spectrometric analysis of the 6 chemical drugs

1.2.4 樣品前處理 準確稱取2.00 g火鍋湯料樣品于50 mL離心管中,加入2.5 mL水,渦旋均勻試樣,加入10 mL 0.1%甲酸-乙腈溶液,渦旋2 min,超聲提取10 min。加入3 g無水硫酸鎂和1.5 g乙酸鈉,渦旋2 min,5000 r/min離心5 min。將上述上清液移取1.0 mL于裝有150 mg MgSO4、100 mg PSA、100 mg C18和50 mg GCB的離心管中,渦旋混合1 min,8000 r/min離心5 min,上清液過0.22 μm有機濾膜后上機測定。

1.3 數據處理

實驗數據采用Waters Xevo TQ-S高效液相色譜串聯質譜儀Masslynx軟件分析處理,坐標圖標采用Excel軟件統計分析,質譜圖采用Photoshop軟件處理。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件優化

2.1.1 提取溶劑的選擇 甲醇和乙腈都是化學藥物檢測中常用的提取溶劑,但實驗過程中用甲醇提取時,加入鹽后無法與水相分層,而乙腈加鹽后能較好分層且在下一步凈化時不需要進行轉換溶劑,可簡化檢測步驟。另外,在化學藥物提取時加入適量的酸既能夠防止部分藥物在堿性條件下發生降解又能更好地去除雜質[22],本實驗比較了乙腈和0.1%甲酸-乙腈兩種提取溶劑的效果,如圖1所示,用0.1%甲酸-乙腈作為提取溶劑時,對乙酰氨基酚、氨基比林和安替比林的回收率明顯提高。因此本實驗采用0.1%甲酸-乙腈體系進行提取。

圖1 不同提取溶劑對6種化學藥物質提取效果Fig.1 Extraction efficiencies of 6 chemicaldrugs with different solutions注:A為0.1%甲酸乙腈,B為乙腈。

2.1.2 凈化吸附劑的優化 乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基硅烷(C18)、石墨化碳黑(GCB)、中性氧化鋁和佛羅里硅土(Florisil)等是QuEChERS方法中常用的凈化吸附劑。為考察不同凈化劑對6種化學藥物的吸附效果,移取1.0 mL濃度為50 ng/mL(阿司匹林500 ng/mL)混合標準溶液分別加入裝有100 mg PSA、C18、GCB、中性氧化鋁和Florisil離心管中,渦旋1 min,8000 r/min離心5 min,上清液過濾后上機測定。由圖2可見,PSA、C18和GCB 3種凈化吸附劑對6種化學藥物的吸附性不大,均有較好的回收率。而中性氧化鋁和佛羅里硅土除了對氨基比林和安替比林吸附性不大外,對對乙酰氨基酚、氯苯那敏、雙氯芬酸鈉和阿司匹林均具有較強的吸附性,因此,選擇PSA、C18和GCB 3種凈化吸附劑進行后續的實驗。

圖2 不同凈化劑對6種化學藥物質回收率影響Fig.2 Effects of different sorbents on therecoveries of the 6 chemical drugs

凈化吸附劑的使用量對待測物回收率也會有較大影響,因此本實驗稱取2.0 g已知空白火鍋湯料樣品,加入100 μL混合標準中間液使檢測終濃度為50 ng/mL(阿司匹林500 ng/mL),然后按照1.2.4方法進行前處理。移取1.0 mL前處理上清分別加入裝有不同質量 PSA、C18和GCB離心管中,渦旋混合1 min,8000 r/min離心5 min,上清液過濾后上機測定。結果如圖3～圖5所示,分別用質量為100 mg的PSA和C18作為凈化吸附劑時,6種化學藥物的回收率均大于80%;用GBC作為凈化吸附劑時最佳用量為50 mg,加大用量會降低6種化學藥物的回收率。因此,本方法最終采用100 mg PSA、100 mg C18和50 mg GCB的組合方案進行凈化。

圖3 PSA加入量對6種化學藥物質回收率影響Fig.3 Effects of PSA dosage on therecoveries of the 6 chemical drugs

圖4 C18加入量對6種化學藥物質回收率影響Fig.4 Effects of C18 dosage on therecoveries of the 6 chemical drugs

圖5 GCB加入量對6種化學藥物質回收率影響Fig.5 Effects of GCB dosage on therecoveries of the 6 chemical drugs

2.2 色譜條件優化

本實驗分別采用了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸水、乙腈-甲酸水和乙腈-甲酸銨水5種流動相體系。通過對分離效果的綜合評價,采用甲酸水-乙腈作為流動相時,6種化學藥物的響應值高,分離度、峰形好,6種化學藥物標準溶液的質譜圖見圖6。為進一步確定流動相中最適的甲酸濃度,本實驗研究了50 ng/mL(阿司匹林500 ng/mL)混合標準溶液在甲酸體積分數在0.01%～0.5%之間時各組分響應值的變化情況,具體結果見圖7,縱坐標為甲酸體積分數下的響應值與最大響應值的比值。結果表明,甲酸體積分數在0.01%～0.1%之間時,大多數組分響應值隨著甲酸體積分數的增加而增強,甲酸體積分數超過0.1%后,6種化學藥物響應值均有所降低。本實驗采用0.1%甲酸水-乙腈作為流動相。

圖6 6種化學藥物質譜圖Fig.6 Mass chromatogram of the 6 chemical drugs

圖7 流動相中甲酸濃度對6種化學藥物響應值的影響Fig.7 Effects of formic acid solubility on the6 chemical drugs value in mobile phase

2.3 標準曲線和檢出限

在1.2.2和1.2.3中確定的色譜條件和質譜條件下,取混合標準工作液用流動相配制1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 ng/mL(阿司匹林為10.0、50.0、100.0、200.0、500.0、1000.0、2000.0 ng/mL)系列濃度的標準溶液上機測定,以各化學藥物的質量濃度(X)為橫坐標,定量離子的響應值峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線,得到各化學藥物的線性方程。如表3所示,6種化學藥物的線性決定系數均大于0.99,表明各組分在1.0～200.0 ng/mL(阿司匹林10.0～2000.0 ng/mL)濃度范圍內均具有良好線性關系。在空白的火鍋湯料樣品中添加適量濃度的混合標準溶液,按照1.2.4進行樣品前處理后質譜分析,以3倍信噪比(S/N)計算儀器檢出限(LOD),結果見表3。

表3 6種化學藥物的線性方程、決定系數和檢出限Table 3 Standard curve,linear correlation and limits of detection of the 6 chemical drugs

2.4 加標回收率和精密度

表4 6種化學藥物的平均回收率和精密度(n=6)Table 4 Average recoveries and precisions(RSDs)of the 6 chemical drugs(n=6)

稱取2.00 g均質好的火鍋湯料空白樣品若干份,分別添加5.0、50.0、500.0 μg/kg(阿司匹林為50.0、500.0、5000.0 μg/kg)3個梯度水平的混合標準溶液,樣品前處理后進行質譜分析,平行測定6次,計算回收率和精密度。如表4所示,各化學藥物的回收率介于72.1%～114.8%,精密度(RSD)為0.81%～14.6%,表明本檢測方法準確度好和精密度高,可滿足實驗室日常分析檢測需求。

2.5 實際樣品的測定

采用本研究建立的檢測方法分別對本市經營餐飲單位的30個火鍋湯料進行6種非法添加化學藥物殘留量的檢測,結果顯示,在所檢的30個批次的樣品中有1個批次檢出對乙酰氨基酚和阿司匹林,后經執法部門跟進調查,該餐飲店承認其在火鍋湯料中添加了含有對乙酰氨基酚、阿司匹林和咖啡因成分的阿咖酚散(俗稱頭痛粉)。

3 結論

本實驗將QuEChERS前處理方法結合超高效液相色譜-串聯質譜技術應用于火鍋湯料中6種非法添加化學藥物對乙酰氨基酚、氯苯那敏、雙氯芬酸鈉、阿司匹林、氨基比林和安替比林的檢測,通過對QuEChERS前處理方法和色譜、質譜條件的優化,建立了定性、定量測定火鍋湯料中6種非法添加化學藥物殘留量的檢測方法。該方法前處理操作簡便,對火鍋湯料基質凈化效果好,在1.0～200 ng/mL(阿司匹林10.0～2000 ng/mL)的質量濃度范圍內,6種非法添加化學藥物的線性決定系數均大于0.99,該方法的檢出限在0.05～1.0 μg/kg之間,加標回收率為72.1%～114.8%,相對標準偏差為0.81%～14.6%。該方法可用于火鍋湯料中非法添加化學藥物的快速篩查,為打擊火鍋湯料中非法添加行為提供有力依據,保證消費者的合法利益。