雞肉酶解物對HepG2細胞抗氧化活性及小鼠血清抗氧化酶活性的影響

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(1.華南農業大學食品學院,廣東廣州 510642;2.畜禽產品精準加工和安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,廣東廣州 510642)

2107年我國禽肉產量為2344.82萬t,其中雞肉占63%,達1477萬t[1]。分割是目前我國肉雞加工的主要方式,雞胸肉是肉雞分割中價格較低廉的產品。雞雞胸肉具有高蛋白、低脂肪、多維生素和微量元素的特點,是一種富含優質蛋白質的食材,每100 g雞肉中含有蛋白質21.73 g[2],雞肉蛋白質的氨基酸組成比例平衡,檢測得到鮮味氨基酸和抗氧化性氨基酸含量較高[3]。

本文在前期研究得出雞肉鹽溶蛋白酶解物SSPH(Salt-Soluble Protein Hydrolysate,SSPH)和雞肉肌纖蛋白酶解物MFH(Muscle Fibrin Hydrolysate,MFH)具有良好體外抗氧化效果的基礎上[10,15],開展了HepG2細胞抗氧化和小鼠體內抗氧化酶活性的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞胸肉(黃羽肉雞) 廣州市江豐實業股份有限公司卓味家禽加工廠提供;酸性蛋白酶(10萬U/g,實測9.8萬U/g) 南寧龐博生物工程有限公司;人肝癌細胞株HepG2 購自中國科學院腫瘤細胞庫;昆明種雄性小白鼠(Specific pathogen Free,SPF級) 廣東省醫學動物實驗中心[實驗動物生產許可證號:SCXK(粵)2013-0002];舒克貝塔實驗鼠維持飼料(小鼠飼料)[全價顆粒飼料,生產許可證:蘇飼證(2014)01008,營養成分執行標準:GB 14924.3-2010,其中,飼料中的粗蛋白含量≥180 g/kg] 江蘇省協同醫生物工程有限責任公司;過氧化氫酶試劑盒(貨號:A007-1-1)、超氧化物歧化酶試劑盒(貨號:A001-3)、谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒(貨號:A005) 南京建成生物工程研究所;DMSO(Dimethyl sulfoxide二甲基亞砜)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS);青-鏈霉素溶液(雙抗)、DEME高糖培養基;HBSS(Hank’s Balanced Salt Solution,Hank’s平衡鹽溶液)、PBS(Phosphate buffered solution,磷酸鹽緩沖液) 均為細胞級,Gibco公司;MTT[Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide,3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽]、AAPH(2,2′-azobis[2-methylpropionamidine]dihydrochloride,偶氮二異丁脒鹽酸鹽)、熒光素鈉、DCFH-DA(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate,2′,7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽) 均為細胞級,Sigma公司;其他試劑和藥品 均為分析純。

多功能酶標儀 美國PerkinElmer;Costa 96孔板美國Corning;25 cm2-透氣蓋細胞培養瓶 美國Corning;CO2細胞培養箱 新加坡ESCO;UV1240分光光度計 島津;DY89-Ⅱ型電動玻璃勻漿機 寧波新芝公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酸性蛋白酶酶解制備雞肉酶解產物 以雞胸肉為原料,經特定工藝提取雞肉鹽溶蛋白(Salt-Soluble Protein,SSP)及雞肉肌纖蛋白(Muscle Fibrin,MF),經酸性蛋白酶酶解制備獲得深度酶解的雞肉鹽溶蛋白酶解物SSPH和肌纖蛋白酶解物MFH。SSP酶解條件:底物濃度為7.0%(w/v)蛋白質含量、E∶S=1 ku/g蛋白質、溫度45 ℃、pH4.0、酶解8 h,酶解物中肽(含氮物)含量27.33 mg/mL;MF酶解條件:底物濃度為7.0%(w/v)蛋白質含量、E:S=3 ku/g蛋白質、溫度45 ℃、pH4.5、酶解8 h,酶解物中肽(含氮物)含量32.31 mg/mL。采用高效凝膠色譜法(色譜柱:TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm)對SSPH及FMH進行分子量分布檢測,結果如表1所示。

表1 雞肉酶解物SSPH與MFH分子量分布所占百分含量(%)Table 1 The molecular weight distribution ofchicken enzymatic lysates SSPH and MFH(%)

1.2.2 雞肉酶解物HepG2細胞的抗氧化活性實驗

1.2.2.1 HepG2細胞培養 將HepG2細胞按常規方法復蘇后,置于含有質量分數10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺和1%雙抗的低糖DMEM培養液中,37 ℃、5% CO2的濕潤培養箱中進行培養,隔天更換培養液,待細胞貼壁融合率達80%左右時,用含質量分數0.02% EDTA的0.25%胰酶消化細胞,按1∶3傳代。取對數生長期細胞進行實驗[16]。

表2 小鼠實驗分組表Table 2 Mice experimental grouping table

1.2.2.2 雞肉酶解物對HepG2細胞存活率的影響 為避免雞肉酶解物對細胞的毒性作用,確定后續實驗的樣品濃度,進行不同濃度條件下樣品對HepG2細胞的存活率實驗。取對數期的HepG2細胞配制成濃度為6×104個/mL的懸液,接種到Costa 96孔板中,每孔加100 μL,于培養箱中進行貼壁培養24 h。培養結束后棄去培養基,用PBS清洗細胞3次,樣品組加入雞肉酶解物,使培養孔中樣品最終濃度分別為50、125、250、500、1000 μg/mL,對照組加入相同體積的無FBS培養液,每組設置5個平行孔,分別于24、48、72、96 h在每孔中加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT試劑,4 h后吸出培養液,加入DMSO 150 μL溶解沉淀,測定490 nm處吸光值,按照式(1)計算細胞存活率[17]。

式(1)

式中:As:樣品組吸光值;Ab:對照組吸光值;Ac:空白組吸光值。

1.2.2.3 雞肉酶解物對HepG2細胞的熒光強度影響 采用細胞內熒光強度測定法,參考文獻[18]。取對數期的HepG2細胞,接種于Costa 96孔板,每孔100μL,約6×104個/mL,加入用DMEM基礎培養基稀釋好的DCFH-DA液100 μL與樣品溶液,使得DCFH-DA終濃度為25 μmol/L,雞肉酶解物最終濃度為12.5、25、50、75、125、250 μg/mL,每個濃度設置5個孔,在37 ℃,5%的CO2培養箱中培養60 min后棄去培養液,加入濃度600 μmol/L ABAP液100 μL,反應10 min,用多功能酶標儀測其熒光值TC。測定條件:溫度37 ℃,發射波長538 nm,激發波長485 nm,每5 min測定一次,跟蹤測定1 h,得到熒光值TC。用 DCFH-DA溶液與含有濃度600 μmol/L的AAPH的HBSS液處理的細胞為陽性對照PC;用DCFH-DA溶液與不含有AAPH的HBSS處理的細胞為陰性對照NC。

1.2.2.4 雞肉酶解物對HepG2細胞的抗氧化活性影響 用Origin 8.0軟件計算時間-熒光強度曲線下的積分面積,并按照式(2)計算細胞內抗氧化活性值(cellular antioxidant activity,CAA)。

式(2)

1.2.3 雞肉酶解物對小鼠體內抗氧化酶活性的影響

1.2.3.1 實驗小鼠準備 選用4周齡雄性成年昆明種小鼠,適應性喂養(溫度保持22±2 ℃,相對濕度保持50%±10%,噪音<60 dB,模擬白天和晚上的時間間隔為12 h,自由進食和飲水);一周后,體重達(27±0.6) g,開始實驗[19]。

1.2.3.2 實驗小鼠分組 將60只小鼠隨機分為6組,每組10只,實驗前逐只稱重,使組間初重差異不顯著(P>0.05)。設置生理鹽水對照組(Saline control,SC)和雞肉勻漿對照組(chicken homogenate control)CHC;實驗組為SSPH和MFH,分別設置40和200 mg/kg·bw·d兩個劑量,每只胃飼(灌胃方法)容量均0.2 mL/d[4]。實驗分組如表2所示。

1.2.3.3 小鼠飼養 實驗小鼠集中飼養于華南農業大學動物實驗中心[許可證編號:SYXK(粵)2014-0136]。每天上午10:00～11:00按時胃飼,定期稱重,實驗為期28 d。

1.2.3.4 血清抗氧化酶活性測定 末次小鼠胃飼后經30 min休息,將小鼠放入放于水深為30 cm,水溫為(25±1) ℃的實驗水箱中游泳30 min后取出,目內眥靜脈采血,血液經3000 r/min離心10 min,收集上層血清,用于測定各項抗氧化酶活性。

谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)的活性測定:采用分光光度法,分別參照相應試劑盒說明書測定。其中,GSH-Px酶活定義為扣除非酶促反應作用,使反應體系中GSH濃度降低1 μmol/L為一個酶活力單位(U);SOD酶活,以SOD抑制率達50%時所對應的酶量為一個SOD活力單位(U);CAT酶活為反應體系中1 mL血清1 s分解1 μmol/L的H2O2的量為一個活力單位(U)。

1.3 數據處理

采用SPSS 19、統計軟件進行單因素方差分析ANOVA,組間比較用LSD法,采用Origin 8進行面積積分計算,用Excel進行實驗數據做圖。

2 結果與分析

2.1 雞肉酶解物對HepG2細胞抗氧化活性的影響

2.1.1 雞肉酶解物濃度對細胞活性的影響 為了解雞肉酶解物是否對HepG2細胞存在毒性作用,確定后續實驗的樣品濃度,進行不同濃度條件下樣品對HepG2細胞的存活率實驗,實驗結果如圖1所示。

圖1 雞肉酶解物濃度對HepG2細胞存活率的影響Fig.1 Effect of chicken enzymatic hydrolysatesconcentration on the survival rate of HepG2 cells

圖1結果顯示,雞肉酶解物SSPH濃度在50～500 μg/mL范圍內,HepG2細胞的成活率均介于87.02%～89.87%;MFH濃度在50～250 μg/mL范圍內,HepG2細胞的成活率均大于90%,濃度500 μg/mL時降為84.50%,濃度增加導致細胞成活率降低。圖1結果表明,雞肉酶解物SSPH及MFH對HepG2細胞均不存在毒性,高濃度條件下細胞成活率降低,應該是因為高滲透壓引起的。

2.1.2 雞肉酶解物對HepG2細胞抗氧化活性的影響

2.1.2.1 雞肉酶解物對HepG2細胞的熒光強度的影響 雞肉酶解物對HepG2細胞熒光強度的實驗結果如圖2所示。

圖2 雞肉酶解物對HepG2細胞熒光強度的影響Fig.2 Effect of chicken enzymatic hydrolysateson fluorescence intensity of HepG2 cells

圖2結果顯示,HepG2細胞熒光強度隨雞肉酶解物濃度的增加而呈下降趨勢,且雞肉酶解物對HepG2細胞熒光強度與空白組相比均有顯著性差異(P<0.05)。DCFH-DA是非標記性的氧化敏感的熒光探針,本身無熒光,可穿過細胞膜進入細胞后,被細胞內的酯酶水解，生成不能通透細胞膜且無熒光的DCFH,DCFH-DA熒光探針很容易地被裝載到細胞內。進入細胞內的ABAP裂解成活性氧(ROS),可將DCFH氧化生成帶有熒光的DCF,通過檢測DCF的熒光強度來判斷細胞內活性氧的水平,熒光強度與細胞內活性氧水平呈正比。圖2結果表明,雞肉酶解物SSPH及MFH均能顯著降低(P<0.05)HepG2細胞內熒光強度,消除細胞內活性氧,提示SSPH及MFH均有明顯的抗氧化活性,且呈良好的劑量-效應關系。細胞抗氧化活性實驗中采用ABAP作為自由基來源,其產生的自由基性質更接近于生物體自然狀態下產生的自由基,因此可以更好地分析抗氧化物質對由自由基引起的生物膜和細胞內物質損失的抑制作用[20-21]。

2.1.2.2 雞肉酶解物對HepG2細胞的細胞抗氧化活性的影響 CAA是一種模擬生理條件,基于細胞模型的抗氧化實驗方法[22]。將雞肉酶解物對HepG2細胞的熒光強度用Origin 8.0軟件進行積分面積,獲得雞肉酶解物抑制ROS氧化DCFH的劑量-效應曲線,結果如圖3所示。

圖3結果顯示,雞肉酶解物SSPH及MFH均有明顯的抗氧化活性,并且存在一定的劑量-效應關系,即抗氧化效果隨SSPH及MFH濃度的增加而增強,當SSPH及MFH的濃度為150 μg/mL時,CAA值分別達到43.17%和46.64%,250 μg/mL時,CAA值分別達到48.03%和47.95%。結果表明,雞肉酶解物SSPH、MFH均具有良好的細胞ROS清除能力,且具有量效關系;雞肉酶解物MFH的清除細胞ROS能力比同等濃度的SSPH高。劉艷等[23]對烏雞低聚肽的細胞抗氧化研究結果顯示,最佳的抗氧化濃度達1000 μg/mL,Halldorsdottir等[24]研究的鱈魚蛋白酶解產物的ROS最強清除能力40%,因此,本研究雞肉酶解物的細胞抗氧化效果更優。

2.3 雞肉酶解物對小鼠血清抗氧化酶活性的影響

雞肉酶解物小鼠血清SOD、CAT及GSH-Px等抗氧化酶活性的影響結果如表3所示。

表3 雞肉酶解物對小鼠血清抗氧化酶活性的影響Table 3 Effect of chicken enzymatic hydrolysates on antioxidative enzyme activity of mouse serum

圖3 雞肉酶解物抑制ROS氧化DCFH的劑量-效應曲線圖Fig.3 Dose-effect curve of chicken enzymatichydrolysates inhibiting ROS oxidation of DCFH

表3結果顯示,雞肉勻漿對照組除GSH-Px酶活顯著高于(P<0.05)生理鹽水對照組外,SOD及CAT酶活均差異不顯著(P>0.05)。高劑量SSPH小鼠血清中的SOD、CAT及GSH-Px三種抗氧化酶酶活性均極顯著高于(P<0.01)生理鹽水對照組及雞肉勻漿對照組;低劑量SSPH小鼠血清SOD酶活顯著高于(P<0.05)雞肉勻漿及生理鹽水對照組,GSH-Px酶活極顯著高于(P<0.01)生理鹽水對照組,但與雞肉勻漿組間差異不顯著,CAT酶活與兩個對照組間差異不顯著(P>0.05)。高劑量MFH小鼠血清中的SOD及GSH-Px兩種抗氧化酶活性均極顯著高于(P<0.01)雞肉勻漿對照組及生理鹽水對照組,CAT酶活顯著高于(P<0.05)兩對照組;低劑量MFH小鼠血清SOD及CAT酶活顯著高于(P<0.05)生理鹽水對照組,GSH-Px酶活極顯著高于(P<0.01)生理鹽水對照組,而與高劑量雞肉勻漿對照組相比,三種抗氧化酶的酶活均差異不顯著(P>0.05)。生物體代謝過程中通常伴隨著產生自由基,它們會損傷蛋白質、核酸、物膜,加速機體的衰老和死亡。生物體內有一套完善的抗氧化酶系統,使自由基的產生與消除處于動態平衡。生物抗氧化酶系統的主要成員包括:超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)等[25]。研究結果表明,雞肉蛋白質經深度酶解處理后,能夠有效提高其對小鼠抗氧化酶活性。研究結果與林琳等[26]、Sun等[27]及Nazeer等[28]的研究成果相一致,動物源性蛋白質酶解物具有較強的抗氧化活性,表現在提高小鼠或大鼠血液中SOD、CAT和GSH-Px的活力,通過增強機體抗氧化酶的活力,增強機體清除自由基的能力,維持著機體內部氧化-抗氧化作用的動態平衡,保證生物體的正常生命活動。

3 結論

通過雞肉酶解物SSPH及MFH對HepG2細胞抗氧化活性分析,結果顯示,當SSPH及MFH的濃度為150 μg/mL時,細胞抗氧化活性CAA值分別達到43.17%和46.64%,表明二者均具有良好的HepG2細胞ROS清除能力,且呈良好的劑量-效應關系。在HepG2細胞培養中,雞肉酶解物SSPH和MFH的添加濃度為500 μg/mL時,HepG2細胞的成活率為84.50%和89.87%,雞肉酶解物對HepG2細胞均不存在毒性。細胞抗氧化實驗中,實驗組的HepG2細胞內熒光強度均顯著低于(P<0.05)空白對照組,并隨雞肉酶解物濃度增加而降低。通過雞肉酶解物SSPH及MFH對小鼠體內抗氧化酶活性的分析,結果顯示,胃飼劑量為40 mg/kg·bw·d的SSPH組的CAT酶活性與生理鹽水及雞肉勻漿對照組間差異不顯著,給小鼠胃飼雞肉酶解物SSPH及MFH劑量為200 mg/kg·bw·d后,小鼠血清中的SOD、CAT及GSH-Px抗氧化酶活性均極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)高于生理鹽水對照組及同劑量雞肉勻漿對照組,表明雞肉酶解物SSPH及MFH能有效提高小鼠體內抗氧化酶活性,促進實驗小鼠的體內抗氧化能力。