長效二氧化氯緩釋劑的制備

孟天宇,劉英丹,婁永江

(寧波大學食品與藥學學院,浙江寧波 315211)

二氧化氯是一種廣譜殺菌劑,在使用過程中無殘留、無毒害,同時可有效地殺滅大多數微生物,對芽孢、病毒和寄生蟲等均有很好地殺滅作用[1]。然而ClO2性質活潑,在空氣中的濃度超過10%時有爆炸危險,且受熱、受光照容易發生分解或氧化[2]。為克服二氧化氯氣體的使用局限性,人們開始研究固體二氧化氯緩釋劑。

土倉滿[3]最初用合成樹脂吸附ClO2水溶液,制成吸附性二氧化氯固體,后又用硬脂酸、蛋白質骨膠等做硅膠替換合成樹脂。Fujita[4]將亞氯酸鈉、硅藻土和聚丙烯酸類樹脂等按照一定比例混合,制成反應型二氧化氯固體緩釋劑。周大軍等[5]將穩定的ClO2高濃度溶液噴灑于固態多孔性硅膠中,制成一種二氧化氯固體緩釋劑。但固體二氧化氯緩釋劑主要存在著殺菌時間短、二氧化氯濃度不可控的問題,從而導致食品中的一些芽孢、孢子等無法被殺滅,在食品儲藏中后期容易變質。同時,GB 2760-2014規定穩定態ClO2做防腐劑時最大使用量不超過50 mg/kg,初始ClO2濃度過高時,不符合我國國家標準。

因此,為了解決上述問題,本研究篩選不同種類活化劑、凝膠劑及氯鹽,研究其對二氧化氯緩釋劑緩釋效果的影響,尋找最佳配比,旨在找到一種濃度可控、有效殺菌時間長、防腐效果優良的ClO2緩釋劑,且降低殺菌劑對食品本身氣味的干擾,將固體二氧化氯更好地應用于食品中。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

亞氯酸鈉 薩恩化學技術(上海)有限公司;草酸、DL-酒石酸、乙二胺四乙酸、氯化鈉、滑石粉(800目) America VWR International;氯化鈣、氯化鉀 國藥集團化學試劑有限公司;硅藻土、海藻酸鈉、可得然膠、卡拉膠、明膠 通化安柏生物科技有限公司;羧甲基纖維素鈉 天津市光復精細化工研究所。

PFS-200型大功率手壓封口機 東莞市青葉包裝機械有限公司;XLA-BX-CLO2型便攜式氣體檢測儀 深圳市普利通電子科技有限公司;Sigma 3k15型冷凍干燥機 德國希格瑪公司;QUANTA-200型掃描電子顯微鏡 美國FEI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 長效二氧化氯緩釋劑的制備 先稱取10 g硅膠,一定量的亞氯酸鈉和水,按比例混合均勻后得到懸濁液A,并將凝膠劑、氯鹽和水混合均勻得到混合物B。然后將二者混合均勻,得到甲劑。接著,稱取8.5 g硅膠,一定量的活化劑和水按照一定比例混合均勻,再加入粘合劑(22 g滑石粉)攪拌均勻,得到乙劑。進一步將甲乙兩劑混合,得到二氧化氯保鮮劑固體。如圖1所示。

圖1 二氧化氯保鮮劑制備流程圖Fig.1 Flowchart of preparation of chlorine dioxide preservative

1.2.2 活化劑、凝膠劑及氯鹽種類的篩選

1.2.2.1 活化劑種類的選擇 在保持18 g NaClO2用量一致的前提下,分別選擇草酸(H2C2O4)、酒石酸(TA)和乙二胺四乙酸(EDTA)各1.8、3.0、5.8 g,選取可得然膠20 g,氯化鈉15 g,制備二氧化氯保鮮劑。并在25 ℃,相對濕度90%,體積0.4 m3恒溫培養箱內進行緩釋,每5 d測定ClO2氣體濃度,每組設置5次平行實驗,計算其ClO2緩釋速率和有效殺菌天數占比 。

1.2.2.2 凝膠劑種類的選擇 在保持18 g NaClO2,5.8 g乙二胺四乙酸用量一致的前提下,分別稱取20 g硅藻土(DE)、海藻酸鈉(SA)、可得然膠(CUD)、卡拉膠(CAR)、羧甲基纖維素鈉(CMC)、明膠(GEL),選取氯化鈉15 g,制備二氧化氯保鮮劑,并在25 ℃,相對濕度90%,體積0.4 m3恒溫培養箱內進行緩釋,每5 d測定ClO2氣體濃度,每組設置5次平行實驗,計算其ClO2緩釋速率和有效殺菌天數占比 。

1.2.2.3 氯鹽種類的選擇 在保持18 g NaClO2,5.8 g乙二胺四乙酸,20 g羧甲基纖維素鈉,用量一致的前提下,分別稱取46.8、44.4 g氯化鈉(NaCl)、氯化鈣(CaCl2),制備二氧化氯保鮮劑,并在25 ℃,相對濕度90%,體積0.4 m3恒溫培養箱內進行緩釋,每5 d測定ClO2氣體濃度,每組設置5次平行實驗,計算其ClO2緩釋速率和有效殺菌天數占比 。

1.2.3 活化劑、凝膠劑及氯鹽配方探究

1.2.3.1 活化劑、凝膠劑及氯鹽用量的確定 根據1.2.2的初步篩選,確定最佳的活化劑為乙二胺四乙酸、凝膠劑為羧甲基纖維素鈉,氯鹽為氯化鈉。在羧甲基纖維素鈉10 g、氯化鈉21 g不變的條件下,分別取5.8、2.9、2.0、1.5、1.0 g乙二胺四乙酸,且根據亞氯酸鈉與氫離子的反應方程確定亞氯酸鈉的量;在乙二胺四乙酸2 g、氯化鈉21 g不變的條件下,分別取8、12、16、20、24 g羧甲基纖維素鈉;在乙二胺四乙酸2 g、羧甲基纖維素鈉10 g不變的條件下,取7、14、21、28、35 g氯化鈉;根據1.2.1中的方法制備二氧化氯緩釋劑,并在25 ℃,相對濕度90%,體積0.4 m3的恒溫培養箱內進行緩釋,每組設置5組平行實驗。比較每組實驗中二氧化氯氣體濃度,選擇合適的活化劑、凝膠劑及氯鹽的用量。

1.2.3.2 活化劑、凝膠劑及氯鹽質量比的確定 在單因素結果的基礎上,以氯化鈉(A)、乙二胺四乙酸(B)、羧甲基纖維素鈉(C)為考察因素,采取正交實驗對影響提取的上述主要因素進行工藝參數優化,如表1,記錄二氧化氯氣體濃度的變化規律,并計算其有效殺菌天數占比。

表1 正交試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 ClO2氣體濃度檢測 稱取2.0 g制得的二氧化氯保鮮劑固體,置于6 cm×8 cm滅菌后的無紡布透氣型包裝袋中并封口,然后將其放置于12 cm×18 cm密封袋中并封口。每天隨機抽取每組樣品5份,用ClO2氣體檢測儀檢測密封袋中的ClO2氣體濃度,共觀察33 d。

1.2.5 ClO2緩釋速率計算 每個樣品緩釋出的二氧化氯氣體濃度降至1 mg/kg時,對大多微生物已不具有殺滅效果,故設置1 mg/kg為本研究中的最低有效濃度。ClO2緩釋快慢程度,以降至1 mg/kg的時間的倒數V來表示,單位d-1。V越小,T越大,保鮮劑釋放二氧化氯氣體越緩慢,有效期越長。

式中:V表示ClO2緩釋的快慢程度,d-1;T表示ClO2氣體濃度降至1 mg/kg時所需要的時間,d。

1.2.6 有效殺菌天數占比 本研究中,有效殺菌天數占比(c)為ClO2氣體濃度在1～50 mg/kg的天數(d)與總檢測天數(D)的比值,用來表現緩釋劑的殺菌效果。有效殺菌天數占比(c)越大,說明該保鮮劑緩釋過程中,濃度不超過50 mg/kg且不低于1 mg/kg的時間越長。

1.2.7 二氧化氯緩釋劑內部結構和形態特征觀察 取緩釋1 d的緩釋劑和緩釋15 d的緩釋劑各1 g,放入2 mL圓底離心管,冷凍干燥48 h后取出,制成粉末狀。用導電膠將樣品粉末粘于樣品臺上,噴金,置于環境掃描電鏡下[6-7],先在低倍下進行觀察,然后在高倍下,觀察其內部結構和形態特征。

1.3 數據分析

本研究中的實驗均重復5次,采用描述統計、方差分析等處理方式,通過Origin 8.0(版本號:8.932.0.932)進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 活化劑、凝膠劑及氯鹽的確定

圖2 不同活化劑制得二氧化氯保鮮劑的緩釋效果Fig.2 Slow-release of chlorine dioxide preservative with different activators

如圖2所示,三種緩釋劑的緩釋速度相近,即釋放出的二氧化氯氣體的濃度低至1 mg/kg的時間相近,這是因為整個體系中可以發生反應的亞氯酸鈉總量有限。乙二胺四乙酸(EDTA)做活化劑時,緩釋劑的有效殺菌時間占比最大,比草酸做活化劑時提高了18%,比酒石酸做活化劑時提高了20%,在緩釋過程中濃度在1～50 mg/kg的時間多于其他兩種。所以,本實驗選擇乙二胺四乙酸為活化劑。

2.1.2 凝膠劑的確定 凝膠劑的微孔結構既可以吸附產生的ClO2氣體,減緩ClO2的擴散速率,使ClO2氣體緩慢地釋放,又可以使包裹有NaClO2的硅膠均勻分布,從而降低整個反應過程中活化劑的弱酸離子的遷移速度,降低NaClO2的反應速率。

硅藻土(DE)內部結構多孔,可利用本身的負電性和吸附性吸附硅膠和NaClO2[8];海藻酸鈉(SA)持水力強,有利于硅膠、NaClO2的附著[9-10];可得然膠(CUD)粘合性較好[11],可以將包裹發生劑的硅膠離子吸附至自身的孔洞中;卡拉膠(CAR)中陰離子性硫酸酯基團可以與游離水分子結合[12],使卡拉膠具有良好的吸水性,其他反應物分子也可進入其凝膠網絡結構中[13];羧甲基纖維素鈉(CMC)是由纖維素改性得到的大分子聚合物,具有很好的粘結力和持水力[14];明膠(GEL)在加熱條件下,可形成凝膠混合物,使其他成分能夠均勻的分布在明膠膠網絡中[15]。故本研究選用這六種凝膠劑,分別制備二氧化氯保鮮劑并測量其二氧化氯氣體濃度,比較二氧化氯氣體緩釋速率和有效殺菌天數占比,如圖3所示。

圖3 不同凝膠劑制得二氧化氯保鮮劑的緩釋效果Fig.3 Slow-release of chlorine dioxide preservative with different gels

如圖3所示,羧甲基纖維素鈉(CMC)的緩釋速度最低,有效殺菌時間占比最大,是因為CMC的粘結力和持水力較好,能均勻地粘結二氧化氯亞氯酸鈉、硅膠及氯鹽,保持了甲劑的均一性[16]。硅藻土(DE)和明膠(GEL)的緩釋速度較大,這是因為加入硅藻土時,由于硅藻土的負電性,大量含有亞氯酸鈉的硅膠離子被吸附,同時硅藻土呈弱酸性[17],一部分硅藻土表面的H+及硅羥鍵和NaClO2發生反應[18],產生大量的二氧化氯氣體;明膠在緩釋過程中能發生交聯反應,形成緩釋層,而且可在不同pH環境下形成不同電性的離子,干擾離子場的形成及活化劑中弱酸離子的遷移[19]。加入可得然膠(CUD)制得的緩釋劑有效殺菌時間占比最低,因為可得然膠需在加熱條件下,可形成高強度凝膠[20],在本研究中部分反應物未能與凝膠完全結合。所以,本實驗選擇羧甲基纖維素鈉為凝膠劑。

2.1.3 氯鹽的確定 在反應中加入凝膠劑后,部分活化劑和亞氯酸鈉被阻隔。加入氯鹽,可以在電勢電位的作用下形成微電場[26],使帶正電荷的弱酸在該環境下逐漸向微孔網絡凝膠中遷移,與NaClO2接觸產生ClO2氣體。同時氯鹽多為不發生反應的中性鹽,可以起到鈍化劑的作用,阻隔反應物直接接觸。為此本研究選擇了NaCl和CaCl2兩種氯鹽,比較二氧化氯氣體緩釋速率和有效殺菌天數占比,如圖4所示。

圖4 不同活化劑制得二氧化氯保鮮劑的緩釋效果Fig.4 Slow-release of chlorine dioxide preservative with different chlorine salt

如圖4所示,加入氯化鈣的緩釋劑的有效殺菌天數占比明顯低于氯化鈉作氯鹽的緩釋劑,這是因為CaCl2在提供電子的同時,也起到了吸濕劑的作用,CaCl2潮解[27]使保鮮劑中水分增加,反應物融合充分[28],反應更劇烈而達不到緩釋的目的。所以,本實驗選擇氯化鈉。

2.2 活化劑、凝膠劑及氯鹽用量對二氧化氯氣體濃度影響的結果

將分別加入8、12、16、20、24 g羧甲基纖維素鈉制得的緩釋劑,標記為CMC-1、CMC-2、CMC-3、CMC-4、CMC-5組,記錄其二氧化氯氣體濃度,濃度如圖5a所示。五組試驗中的二氧化氯氣體濃度整體呈下降趨勢,其中CMC-2組的初始濃度和最大濃度最低,第33 d時的濃度仍大于1 mg/kg。減少CMC的量到8 g(CMC-1組)時,其初始濃度略高于第二組;增加到16 g(CMC-3組)時,其初始濃度大于第二組且遠超50 mg/kg 的濃度標準。所以該實驗中,加入羧甲基纖維素鈉最佳范圍為8～12 g。

將分別加入5.8、2.9、2.0、1.5、1.0 g的乙二胺四乙酸制得的緩釋劑,標記為EDTA-1、EDTA-2、EDTA-3、EDTA-4、EDTA-5組,如圖5b所示。前4組緩釋劑釋放出的二氧化氯氣體濃度呈先上升后下降趨勢。其中第3組緩釋劑的最高濃度小于國家標準要求且有效殺菌時間較長。第5組由于酸含量過少,亞氯酸鈉可能未完全反應,導致產生二氧化氯氣體過少,有效緩釋時間短。所以該實驗中,加入乙二胺四乙酸2 g最佳。

分別取7、14、21、28、35 g氯化鈉制得的緩釋劑,標記為NaCl-1、NaCl-2、NaCl-3、NaCl-4、NaCl-5組,如圖5c所示。5組緩釋劑在第33 d時的濃度均大于1 mg/kg,其中二氧化氯緩釋濃度整體較低且有效殺菌時間最長的為第4組。所以該實驗中,加入氯化鈉28 g最佳。

圖5 活化劑、凝膠劑及氯鹽對二氧化氯氣體濃度的影響Fig.5 Effects of activator,gel and chlorine salt on the concentration of chlorine dioxide

2.3 長效二氧化氯緩釋劑最優配方比的確定

2.3.1 配方優化安排及結果分析 在2.2實驗結果的基礎上,選擇NaCl為氯鹽,EDTA為活化劑,CMC為凝膠劑,按照表1,對影響提取的上述主要因素進行工藝參數優化,采用正交表L9(34)進行三因素三水平試驗,如表2所示。本正交試驗的誤差值小(0.02),數據可信。A、B、C三個因素的R值和空白列誤差相比差異明顯。三個因素對ClO2緩釋過程的影響力依次為:NaCl>CMC>EDTA,影響最大的是NaCl,綜合考慮確定最佳方案為CMC∶EDTA∶NaCl=14∶1∶5。

表2 配方優化結果分析表Table 2 Formula optimization analysis

2.3.2 配方優化結果驗證 在25 ℃,相對濕度50%環境下,按優化后的配比,設置5組平行實驗,記錄ClO2氣體濃度隨時間的變化情況,如圖6所示,優化后的緩釋劑釋放出的二氧化氯氣體最高濃度不超過50 mg/kg,有效殺菌天數28 d,占比84.85%。

圖6 二氧化氯氣體濃度變化Fig.6 Change of chlorine dioxide concentration

2.3.3 不同緩釋天數對二氧化氯緩釋劑內部結構和形態特征的影響 在電鏡下,放大650、1500、3000倍，分別觀察緩釋1 d和緩釋15 d的保鮮劑的內部結構,如圖7所示。配方優化后的二氧化氯緩釋劑內部為致密的微孔網絡結構,顆粒排列緊密且有一定規則。緩釋劑中90%以上的微孔小于10 μm,圖7a為剛開始釋放ClO2的緩釋劑內部結構,圖7b為緩釋15 d后的二氧化氯緩釋劑的內部結構。比較兩圖可以看出,緩釋劑的內部形態與緩釋時間有關,1 d時,緩釋劑剛開始反應并釋放二氧化氯氣體,內部微孔排列較緊密。15 d時,緩釋劑內部微孔數量增加且孔隙略大,反應產生的二氧化氯氣體儲存在微孔結構中并緩慢釋放到環境中。

圖7 二氧化氯緩釋劑內部結構Fig.7 Internal structure of chlorine dioxide sustained-release agent

3 結論

本研究研發了一種殺菌防腐效果佳,濃度可控制在國家標準范圍內的ClO2緩釋劑,將緩釋型二氧化氯更好地應用于食品保鮮中。研究發現選用EDTA為活化劑,可使有效殺菌時間延長20%;選用羧甲基纖維素鈉(CMC)為凝膠劑時,二氧化氯氣體緩釋速率最小且有效殺菌時間較長;選用NaCl為氯鹽,提供微電場環境的同時能鈍化反應物。當CMC、EDTA和NaCl的質量比為14∶1∶5時,得到的保鮮劑的有效殺菌時間(濃度為1～50 mg/kg的時間)達28 d。在電鏡下觀察優化后的保鮮劑,其內部結構為致密的微孔網絡結構,顆粒排列緊密且有一定規則,反應產生的二氧化氯氣體可儲存在緩釋劑的微孔結構中并實現緩慢釋放。

本研究著重研發了緩釋時間1個月左右的ClO2緩釋劑。若想將二氧化氯更廣泛的應用于食品保鮮或其他領域中,就需要進一步研究更有效的凝膠劑、鈍化劑或其他緩釋材料,或開發新型的包裝材料和包裝方式,使緩釋劑有效期更長。