高壓、加熱預處理菜籽蛋白對其酶解物生物活性的影響

吳 剛,鄒智鵬,何 榮,王明潔

(1.安徽科技貿易學校食品工程系,安徽蚌埠 233000;2.南京財經大學食品科學與工程學院,江蘇南京 210023)

據WHO統計,心血管疾病已成為全球最大的致死因素,而高血壓是造成心肌梗塞、中風、血管性癡呆等心血管疾病的主要原因之一[1-2]。腎素-血管緊張素系統(RAS)是重要的機體血壓調節系統,而血管緊張素轉換酶-Ⅰ(ACE)和腎素是該系統的2個重要的水解酶[3],腎素水解血管緊張素原生成血管緊張素-Ⅰ,ACE能夠催化血管緊張素-Ⅰ轉變成致使血管收縮的血管緊張素-Ⅱ,大量的血管緊張素-Ⅱ會與血管緊張素受體結合進而使血管收縮,同時ACE將具有使血管舒張作用的緩激肽失活,引起醛固酮的釋放,從而導致血壓升高[4]。此外,氧化應激與高血壓也有著密不可分的關系,氧化應激產生的活性氧自由基(ROS)會攻擊身體的健康細胞,導致血管損傷,進而導致血管功能的紊亂,失去其結構和功能,造成機體血壓升高[5-6]。研究表明,許多食物蛋白酶解物都具有顯著的降血壓活性功能,例如綠豆蛋白經過2 h的堿性蛋白酶水解顯示出良好的ACE抑制作用,玉米蛋白粉在堿性蛋白酶水解5 h后顯示ACE抑制生物活性[7-8]。Patricia等[9]用堿性蛋白酶酶解得到豌豆多肽不僅具有ACE抑制活性,還具有氧自由基吸附能力(ORAC)。除ACE抑制活性外,有研究表明食源性多肽可以抑制腎素的活性[10]。也有研究認為菜籽蛋白水解物具有較強的抗氧化性和抗腫瘤活性[9]。食物源活性多肽由于其安全性和功能性現已成為食品行業研究的熱點之一[10]。

天然食品中含有大量的生物活性肽,但利用率較低。最近研究表明高壓、加熱及加酶等可以改善蛋白質中活性肽的釋放,例如高壓可以促進蛋清蛋白釋放更多活性肽以及提高乳清蛋白的水解度[11-12],可以促進扁豆蛋白和大豆蛋白釋放ACE抑制多肽以及提高其抗氧化活性[13-14]。利用高溫高壓預處理豌豆蛋白的研究表明高壓與高溫可以改變蛋白質的生物活性[15-17]。此外酶解溫度與酶濃度會影響馬氏珠母貝肉酶解產物的生物活性[18]。目前國內外對于高壓、加熱預處理菜籽蛋白對其酶解物生物活性影響研究較少。

本研究旨在確定高壓或熱預處理分離菜籽蛋白在不同酶含量下對酶解蛋白肽水解度、ACE、腎素抑制特性,以及清除自由基能力的影響。為菜籽蛋白的合理利用提供充分的科學依據與理論基礎,改善菜籽蛋白水解物的生物活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菜籽粕 東海糧油工業有限公司;堿性蛋白酶(Alcalase 2.4 L活力≥200000活力單位/g) 諾維信酶制劑公司;血管緊張素轉化酶-I(ACE)、N-[(2S,3R)-3-氨基-2-羥基-4-苯丁酰]-L-亮氨酸(FAPGG)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧基(Trolox)、熒光素、2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(APPH)、亞油酸、菲洛嗪、原型谷胱甘肽(GSH) Sigma公司;腎素活性測定試劑盒 美國Cayman Chemical公司;96孔白色底部透明微孔板 美國Corning公司;鹽酸、氫氧化鈉等所用試劑,均為分析純 購于Fisher公司。

Spectra-Max M2e酶標儀 美國Molecular Devices公司;FP-6300熒光分光光度計 日本JASCO;PHS-25型pH計 上海精密科學儀器有限公司;臺式離心機TDL-5-A 上海安亭科學儀器廠;真空冷凍干燥機ALPHAI-4LD pluo 德國Marin Christ公司;4-1 HP高壓反應系統 包頭科發高壓科技有限責任公司;IKA磁力攪拌器 德國IKA儀器設備有限公司;HH-2數顯水浴鍋 常州國華電器有限公司;U-3900紫外可見分光光度計 日本 HITACHI 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菜籽分離蛋白的制備 菜籽粕脫脂,根據何榮[19]方法從脫脂菜籽粕中提取菜籽分離蛋白。將脫脂菜籽粕粉碎、過80目篩,溶解于10倍(m/V)的蒸餾水中,用1 mol/L NaOH調節pH為11.0,并維持不變,置于室溫2 h(期間不斷攪拌)后,8000×g離心1 h(4 ℃),收集上層清液;用1 mol/L HCl調節pH至4.5,靜置2 h后離心,得到下層沉淀蛋白。用乙醇洗滌沉淀兩次,在沉淀蛋白質入少量蒸餾水,攪勻,調節pH為7.0后,使用截留量為1 kDa的透析袋在蒸餾水中透析脫鹽,在4 ℃下每2 h更換蒸餾水,經12 h后冷凍干燥,得到菜籽分離蛋白。

1.2.2 菜籽蛋白的高壓處理和熱處理及水解物的制備 采用用50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH=7.5)制備1%的菜籽分離蛋白懸濁液,置于4 ℃條件下攪拌12 h。將懸浮液密封在聚乙烯袋中,然后放入可以調節溫度與壓力的高壓裝置中。在保持25 ℃條件下,調節壓力為200、400和600 MPa,分別處理15 min。同樣地,將懸浮液分別在60、80和100 ℃條件下分別水浴加熱15 min,冰水冷卻后冷凍干燥[20]。采用何榮[19]描述方法來制備菜籽蛋白水解物,將經過高壓與加熱處理的以及未經處理的菜籽蛋白分別溶解于蒸餾水中,配制成濃度為5%的溶液,調節pH8.0、溫度50 ℃,攪拌1 h后,分別加入1%、3%和5%的堿性蛋白酶Alcalase(以樣品蛋白質算)常壓下水解4 h,水解過程中通過滴加1 mol/L的NaOH保持反應溶液的pH恒定。水解反應結束后,將水解物加熱至90 ℃保溫10 min滅酶,冰水浴快速冷卻后以8000×g離心1 h,取上清液紗布過濾后冷凍干燥在-20 ℃條件儲藏備用。

1.2.3 活性測定

1.2.3.1 蛋白質水解度(DH)的測定 采用pH-Stat法[21]測定蛋白質的水解度。

式(1)

式中:c為NaOH的濃度(mol/L);V為NaOH消耗的體積(mL);a為樣品分離蛋白氨基平均解離度;m為蛋白質質量(g);h為每克蛋白質底物具有的肽鍵毫摩爾數(取h=718 mmol/g)。

1.2.3.2 ACE抑制活性的測定 根據王鳳章[4]與Wang等[22]方法測定菜籽蛋白水解物的ACE抑制活性,并進行部分改進。在比色皿中加入1 mL 0.5 mmol/L FAPGG(溶解于50 mmol/L HEPES緩沖液,含0.3 mol/L NaCl,pH7.5),20 μL ACE(1U/mL,最終活力為 20 mU),200 μL樣品(溶解于上述緩沖液,最終濃度1 mg/mL)。在室溫下混勻,于10 min內在340 nm下測定吸光值的降低速率。空白以HEPES緩沖液代替樣品,根據公式(2)計算ACE。

式(2)

式中:ΔA·min-1(樣品)和ΔA·min-1(空白)分別是表示樣品和空白的ACE活性變化速率。

1.2.3.3 腎素活性的測定 采用Ciau-Solis等[23]描述的方法,使用腎素抑制劑篩選試劑盒測定菜籽蛋白水解物的腎素抑制活性。具體步驟為:在96孔板中依次加入a空白:20 μL底物、160 μL測試用緩沖液、10 μL超純水;b空白對照:20 μL底物、150 μL測試用緩沖液、10 μL超純水;c樣品:20 μL底物、150 μL測試用緩沖液、10 μL樣品(最終質量濃度為1 mg/mL)。然后分別向每個孔中加入10 μL腎素以啟動反應,37 ℃條件下預熱15 min后,在10 min內測定樣品的熒光強度(FI),激發波長340 nm,發射波長490 nm。根據式(3)計算樣品的腎素活性抑制率。

式(3)

式中:ΔFI·min-1(樣品)和ΔFI·min-1(空白)分別表示樣品和空白的腎素活性變化速率。

1.2.3.4 氧自由基吸附能力(ORAC)的測定 根據Girgih等[16]及Xiang等[24]的方法測定菜籽蛋白水解物的氧自由基吸附能力。將樣品溶解于75 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(AAPH、Trolox和熒光素也用該溶液配制),使其濃度為50 μg/mL。在96孔板中依次加入120 μL熒光素(0.008 μmol/L)和20 μL 的樣品或者濃度分別為6.25、12.5、25、50 μmol/L抗氧化劑Trolox,在37 ℃下保溫15 min后,向每個樣品孔中加入60 μL AAPH(150 mmol/L)以啟動反應,用熒光分光光度計在1 h內每隔1 min 記錄一次樣品的熒光強度(激發波長485 nm,發射波長530 nm)。抗氧化劑作用時熒光衰減曲線下面積分面積,扣除無抗氧化劑的空白曲線下面積,得出抗氧化劑的保護面積(AUC)。通過對比樣品熒光衰退曲線的AUC與標準抗氧化劑Trolox的AUC,計算樣品的ORAC值(單位表示為μmol TE/mg pro)。

1.2.3.5 Fe2+螯合能力的測定 采用 Xie等[25]的方法測定樣品的金屬螯合能力。1 mL肽樣品溶液或 GSH(最終測定濃度 1 mg/mL)在反應管中與0.05 mL 2 mmol/L的FeCl2和1.85 mL蒸餾水混合。加入0.1 mL菲洛嗪溶液(5 mmol/L)并充分混合。將混合物在室溫下靜置10 min,再從中取出200 μL的等分試樣添加到一個干凈的96孔板中。另外還要通過用1 mL蒸餾水更換樣品進行控制。采用分光光度計測量在562 nm處的吸光度值(Ac)和(As),并將樣品的金屬螯合劑活性與GSH的進行比較。按公式(4)計算樣品的Fe2+螯合能力。

螯合率(%)=(AC-AS/AC)×100

式(4)

式中:AS為加入樣品測得的吸光度;AC為試劑空白吸光度(純水)。分別測試最終濃度1、2、3、4、5 mg/mL樣品的Fe2+螯合能力,采用非線性回歸計算其EC50值(螯合50% Fe2+時的樣品濃度)。

1.3 數據分析

采用SAS軟件對實驗數據進行單因素方差分析(ANOVA)、Duncan多重比較,顯著差異選用P<0.05。每組試驗重復三次,結果均采用平均數±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 不同處理菜籽蛋白在不同酶含量下的水解度的變化

用堿性蛋白酶水解高壓和熱處理的的菜籽蛋白得到的水解曲線如圖1所示。在不同的處理條件下,菜籽蛋白的水解度隨著反應時間延長逐漸增大。在酶含量1%的條件下,前30 min對照組與100 ℃條件下的菜籽蛋白水解度上升幅度比其他條件下的水解度上升幅度大,且在210 min增長到最大值,高壓與加熱處理的菜籽蛋白與對照組水解度差異明顯。在酶含量3%的條件下,前30 min內60 ℃處理過的菜籽蛋白水解度上升幅度要高于其他條件處理的菜籽蛋白的水解度上升幅度,且240 min內的水解度與其他處理條件下的水解度有較為明顯的差異,略低于對照組的水解度。在酶含量5%的條件下,前30 min內水解度上升幅度最大,并且在240 min時達到最大值,反應240 min內對照組與高壓及加熱處理的菜籽蛋白水解度差異較為明顯。同一壓強或溫度下,酶含量在3%與5%的菜籽蛋白水解度差異較小,說明堿性蛋白酶的最佳加酶量在3%～5%,60 ℃處理的菜籽蛋白水解度在3%與5%的酶含量下要比1%酶含量的要高2.46%±0.36%。可以看出經高壓及熱處理菜籽蛋白水解度都有所降低,且高壓與熱處理的菜籽蛋白水解度差異不大,都低于未經處理的對照組水解度。這與黨斌、遲玉杰等[26-27]研究結果相同,壓強、溫度過高會破壞其結構,從而喪失或部分喪失活性,致使蛋白水解度下降。但與Guan等[15]研究結果相反,高壓會打開蛋白質結構,暴露更多酶解位點,水解度增加。

圖1 不同處理菜籽蛋白在不同酶含量下的水解度曲線Fig.1 Hydrolysis curve of different processed rapeseed proteins at different enzyme contents注:A、B、C分別代表菜籽蛋白在酶含量為1%、3% 和5%下的水解曲線。

2.2 不同處理菜籽蛋白在不同酶含量下的ACE抑制活性的變化

高壓及熱處理的菜籽蛋白在不同的酶含量條件下的ACE抑制活性如圖2所示。適宜的高壓處理有利于釋放更多活性ACE抑制肽,主要來自菜籽蛋白的3%、5%濃度堿性蛋白酶水解。在1% 酶濃度下200、400、600 MPa處理菜籽蛋白的ACE抑制活性與同濃度下的對照組相比提高明顯。菜籽蛋白的400 MPa處理導致通過5%堿性蛋白酶濃度產生最活躍的ACE抑制肽(抑制率58.76%±1.02%)。菜籽蛋白的高壓處理可能導致蛋白質結構變化,其有利于肽鍵的水解,ACE抑制肽的釋放比非活性肽更多[20],與對照組相比,熱處理在不同酶濃度下對菜籽蛋白ACE抑制活性普遍有所提高,主要表現在菜籽蛋白的1%、3% 酶濃度下的水解。 80 ℃處理的菜籽蛋白在1%、3%、5%酶濃度下ACE抑制活性提高顯著(P<0.05)。熱處理可能改變了菜籽蛋白水解物的構象,使得堿性蛋白酶水解的肽鍵不同于對照組水解的肽鍵,導致菜籽蛋白在熱處理條件下ACE的抑制活性有增強的效果,Guan、Chao等[15,17]研究表明高壓可以增強分離蛋白的ACE抑制活性并且涂丹[28]的研究表明加熱處理可以提高魚鱗蛋白的水解度及ACE抑制率。研究認為高壓、熱處理可以改善菜籽蛋白的ACE抑制活性。

圖2 不同處理菜籽蛋白在不同酶含量下的血管緊張素轉化酶(ACE)抑制活性Fig.2 Angiotensin-converting enzyme(ACE) inhibitory activity of different processed rapeseed proteins at different enzyme contents注:字母不同代表差異顯著(P<0.05);圖3～圖5同。

2.3 不同處理菜籽蛋白在不同酶含量下的腎素抑制活性的變化

除ACE抑制肽能有效降低機體血壓外,腎素抑制肽也可能具有很好的降血壓效果[29]。由圖3可知,高壓處理菜籽蛋白在不同酶濃度下產生的腎素抑制活性增長不同,其中3%、5%酶濃度下經高壓處理的菜籽蛋白能產生更多的腎素抑制肽,1%酶濃度下產生相反的結果,這可能與菜籽蛋白的水解度有關。600 MPa處理的菜籽蛋白在5%酶濃度下的腎素抑制率明顯高于其他酶濃度下的抑制率,并且壓強越高差異越大。熱處理使菜籽蛋白水解物的腎素抑制率均高于高壓處理及對照組的腎素抑制率并且有顯著性差異(P<0.05)。在酶濃度為5%下,80 ℃處理菜籽蛋白水解物產生最好的腎素抑制活性。在相同熱處理下不同酶濃度對腎素抑制率影響較小。研究可知熱處理可以提高菜籽蛋白水解物的腎素抑制活性,與Chao等[17]研究結果高壓高溫會改善豌豆蛋白腎素抑制活性有相同的趨勢且大多數熱處理條件下的菜籽蛋白水解物在1 mg/mL的測試濃度下所獲得的腎素抑制率都要高于亞麻籽蛋白質水解物在7.5 mg/mL濃度下獲得的最大腎素抑制率44.5%[30]。

圖3 不同處理菜籽蛋白在不同酶含量下腎素抑制活性變化Fig.3 Changes in renin inhibitory activity of different processed rapeseed proteins at different enzyme contents

2.4 不同處理菜籽蛋白在不同酶含量條件下氧自由基吸附能力的變化

高溫及熱處理菜籽蛋白的水解物吸附氧自由基的能力如圖4所示,GSH顯示出最強的抗氧化能力(1333.98±48.43 μmol/L TE/mg pro),其次是對照組中酶含量1%的菜籽蛋白水解物的抗氧化能力(1266.48±34.75 μmol/L TE/mg pro),與對照組相比,高壓處理菜籽蛋白后的水解物氧自由基吸附能力能力明顯下降(P<0.05)。加熱處理菜籽蛋白的氧自由基吸附能力也出現下降的趨勢。Girgih等[16]研究表明高壓預處理豌豆蛋白的酶解產物具有良好的抗氧化活性。研究認為高壓及熱處理對菜籽蛋白水解物的氧自由基吸附能力有抑制作用。但與其他相關研究相比,菜籽蛋白水解物表現出相當高的氧自由基吸附能力。例如,Zhou等研究玉米蛋白中性蛋白酶水解物的ORAC值在65.6～191.4 μmol TE/g[31],Wattanasiritham等[32]用胰酶水解米糠蛋白的水解物的ORAC值為75 μmol TE/mg,這些測定結果都略低于本研究結果。

圖4 不同處理菜籽蛋白在不同酶含量下氧自由基吸附能力的變化Fig.4 Changes of oxygen free radical adsorption capacity of different processed rapeseed proteins at different enzyme contents

2.5 高壓及熱處理菜籽蛋白在不同酶含量下的Fe2+螯合能力的變化

過渡元素金屬離子,例如Fe2+,能夠催化活性氧(ROS)的生成,活性氧能促進氧化而破壞重要的細胞化合物如DNA和蛋白質;此外,體內某些神經性疾病的發病機制也與該氧化有關[33]。因此,具有Fe2+螯合作用的生物活性肽能夠防止或者減少由Fe2+催化的ROS的生成。高溫及熱處理菜籽蛋白的水解物Fe2+螯合能力如圖5所示,對照組菜籽蛋白水解物的Fe2+螯合能力較弱,且與其他高壓及熱處理的菜籽蛋白水解物在1%、3%和5%酶含量下的Fe2+螯合能力均有顯著性差異(P<0.05)。600 MPa、60 ℃、80 ℃處理下1%酶含量的菜籽蛋白水解物與100 ℃條件下3%、5%酶含量的菜籽蛋白水解物有較強的Fe2+螯合能力,其中60 ℃處理下1%酶含量的水解物 EC50值最低,為(0.0167±0.004 mg/mL),說明該條件下的水解物具有最強的Fe2+螯合能力,董世媛等也通過堿性蛋白酶和風味蛋白酶水解鰱魚蛋白得到了具有較強Fe2+螯合能力的水解物[34]。因此高壓與熱處理會提高菜籽蛋白水解物的Fe2+螯合能力。

圖5 高壓及加熱處理菜籽蛋白在不同酶含量下Fe2+螯合能力的變化Fig.5 Changes of Fe2+ chelation ability of rapeseed protein at different enzyme contents under high pressure and heat treatment

3 結論

研究了高壓及熱處理后的菜籽蛋白在不同酶含量下水解度的變化以及對菜籽蛋白水解物的ACE、腎素抑制活性及抗氧化性的影響。由實驗可知,在不同酶含量條件下高壓及加熱處理會降低菜籽蛋白的水解度;在同一壓強或溫度下,酶含量的不同對ACE抑制率影響較大,但相同酶含量下壓強與熱處理對菜籽蛋白水解物的ACE活性影響較小。與對照組相比,酶含量5%的菜籽蛋白經高壓處理與熱處理對菜籽蛋白水解物的腎素抑制率有促進作用,且對腎素活性影響顯著(P<0.05),可以考慮用加熱的方法提高菜籽蛋白水解物腎素抑制活性。抗氧化研究表明,與對照組相比,高壓及熱處理對不同酶含量的菜籽蛋白水解物的氧自由基吸附能力有抑制作用,并且經過處理的高壓及高溫預處理的菜籽蛋白在1%酶含量條件下氧自由基吸附能力與對照組相比存在顯著差異(P<0.05);對于Fe2+螯合能力來講,高壓與熱處理對Fe2+螯合能力有促進作用,并且與對照組相比有顯著性差異(P<0.05),其中60 ℃處理下1%酶含量的水解物 EC50值最低,為(0.0167±0.004) mg/mL。研究認為高壓與熱處理菜籽蛋白對于不同酶含量水解物生物活性具有一定的改善作用,高壓及熱處理可以促進菜籽蛋白釋放更多活性肽進而提高ACE、腎素抑制活性,并且可以大幅增強菜籽蛋白水解物的Fe2+螯合能力,高壓及熱處理是一種高效釋放菜籽分離蛋白活性肽的技術,因此論文為菜籽蛋白的產業化應用提供了理論依據,這一技術有利于從菜籽蛋白提取生物活性肽,將該技術應用于食品行業分離蛋白,為菜籽蛋白降血壓制劑的開發和相關功能性產品的應用提供了參考。