酸湯中乳酸菌的鑒定及其耐酸、耐膽鹽和抗氧化活性

王祎然,韋明明,張 涵,周天瑞,姜 梅

(南京農業大學食品科技學院,江蘇南京 210095)

酸湯是我國貴州地區的一種傳統發酵調味品,也是貴州黔東南最具影響力的支柱產業。酸湯品種可根據原料(米酸湯、魚酸湯、毛辣角酸湯等)、地域、色澤、風味等來劃分。著名的凱里市紅酸湯就是以野生毛辣果(番茄)、鮮紅辣椒、木姜子、糯米、大蒜等為原料,經清洗、破碎、加水、加鹽、入壇發酵而制成[1]。發酵后的酸湯富含多種有機酸(乳酸、乙酸、檸檬酸等)、礦物質(鈣、磷、鐵等)、氨基酸和維生素,具有散寒消脹、止瀉抑菌、延緩細胞衰老的功效[2]。酸湯發酵的主要功能菌為乳酸菌,其發酵產生的鮮味氨基酸和醇、醛、酸等物質,賦予酸湯醇香清爽的獨特風味[3-4]。乳酸菌還能提高酸湯中番茄紅素和酚類等天然抗氧化物的含量,通過糖苷水解酶提高其抗氧化活性及消化率,在人體內發揮整腸[5]、抑菌[6]、抗腫瘤[7]、抗氧化[8-10]等保健功效。研究表明,乳酸菌功能性食品的功效作用與其能否適應胃腸轉運過程中低pH和高膽鹽濃度的環境密切相關[5]。

目前我國對貴州酸湯的研究不多,僅局限于對其營養成分[1-3]、發酵工藝[11]和微生物區系[3]的探討,對酸湯源乳酸菌的研究較少。國內外學者對其他發酵蔬菜中乳酸菌的益生特性進行了研究。龔加路等[12]對四川泡菜中1株高產酸的戊糖乳桿菌進行了人工腸液、胃液和膽鹽耐受試驗。Khan等[13]研究了韓國泡菜中1株植物乳桿菌的抑菌活性及機理,并測定其耐酸、耐膽鹽特性。近年來,具有良好胃腸道耐受性的乳酸菌發揮抗氧化活性的能力引起了學者的關注。Pourramezan等[14]對21株乳品源乳桿菌進行耐酸、耐膽鹽試驗,并以清除活性氧和DPPH自由基的指標評估其體外抗氧化能力。Xu等[15]對我國發酵食品中的乳酸菌進行pH、膽鹽和過氧化氫耐受試驗,對其細胞的膽鹽水解酶和抗氧化活性進行了體外評估。但對發酵蔬菜中的乳酸菌進行此類研究的學者還較少[16],對酸湯源乳酸菌同時進行耐酸、耐膽鹽和抗氧化能力的研究目前還沒有。

本文對酸湯中篩選出的6株產酸能力強、發酵性能優良的乳酸菌進行形態觀察和生物學鑒定;對6株菌進行耐酸、耐膽鹽試驗,并分析其作為益生菌的潛在能力;以清除1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基和羥基自由基為指標進行體外抗氧化研究,以期為我國益生菌資源的研究和酸湯源乳酸菌的開發利用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸菌(共6株,分別為JMST-1、JMST-2、JMST-5、JMST-7、JMST-8、JMST-9)篩選自貴州酸湯產品的乳酸菌 南京農業大學食品科技學院微生物實驗室選育并保藏;溶菌酶、蛋白酶K、細菌16S rDNA通用引物、dNTP、酵母26S rDNA的通用引物、Loading Buffer、瓊脂糖、核酸染料、DNA Buffer、TaqDNA 聚合酶 分析純,北京全式金試劑有限公司;DPPH自由基清除活性測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;其他常規生化試劑 分析純。

IS128 pH計 上海儀邁儀器科技有限責任公司;64RL離心機 美國Beckeman公司;DYY-2C電泳儀、電泳槽 北京市六一儀器廠;Mycycler PCR擴增儀、Dcode System梯度凝膠生成設備 美國Bio-rad公司;CDS8000凝膠成像分析系統 上海培清科技有限責任公司;722S可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 形態觀察和生化鑒定 將6株菌以3%接種量接種于新鮮配制的 MRS 液體培養基中,于37 ℃培養 24 h,活化兩次備用。取活化后的菌液于MRS培養基上劃線,37 ℃ 培養24 h,觀察菌落顏色、形狀大小、光滑程度、邊緣狀況等特征;挑取單菌落進行過氧化氫酶試驗和革蘭氏染色,顯微鏡下觀察菌株顏色、形狀、排列方式等特征。

1.2.2 分子生物學鑒定 菌株的DNA提取采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyl trimethyl ammonium bromide,CTAB)-溶菌酶法[17]。采用細菌16S rDNA通用引物進行擴增:正向引物27F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′),反向引物1492R(5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)。反應體系為:DNA模板1 μL、dNTP 2 μL、引物27F 1 μL、引物1492R 1 μL、10×DNA Buffer 2.5 μL、Taq DNA 聚合酶 0.1 μL、去離子水17.4 μL。擴增程序為:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性1 min、56 ℃退火1 min、72 ℃延伸2 min,循環30次;72 ℃終延伸10 min;于4 ℃保存。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產物進行檢測,目標片段約在1500 bp左右處。將PCR 擴增產物送至生工生物工程(上海)有限公司測序,在 NCBI 網站GenBank中進行 BLAST 分析,同時在 EzBioCloud數據庫選取參考菌株進行同源性比對,一般將序列相似度在99%～100%之間的菌株判定為同一個種。選取適宜的參考菌株序列,采用MEGA 6.0 軟件的Neighbor-Joining 法進行1000次步長構建系統發育樹。

1.2.3 益生特性試驗

1.2.3.1 耐酸能力測定 用鹽酸制備pH為2.5的MRS液體培養基,取100 μL活化后的菌液接種于10 mL MRS鹽酸培養基中,置于37 ℃培養箱,于0、3 h進行活菌平板計數,平行試驗3次。

1.2.3.2 耐膽鹽能力測定 配制豬膽鹽含量為0.3%的MRS液體培養基,取100 μL活化后的菌液接種于10 mL MRS膽鹽培養基中,置于37 ℃培養箱,于0、3 h進行活菌平板計數,平行試驗3次。

1.2.3.3 存活率計算

式(1)

式中:N1表示3 h測定的活菌數,lg CFU/mL;N0表示0 h測定的活菌數,lg CFU/mL。

1.2.4 抗氧化能力試驗

1.2.4.1 菌懸液制備 取活化后的菌液于5000 r/min離心15 min,用磷酸緩沖液清洗重懸,重復2次。用分光光度計調整菌體濃度為108CFU/mL(A600=0.5±0.05對應菌體濃度×108CFU/mL),作為菌懸液待用。

1.2.4.2 DPPH自由基清除能力測定 測定方法參考Lin等[18],并略有改進:取2 mL菌懸液,加入2 mL(0.4 mmo1/L)DPPH自由基-無水乙醇溶液,混勻,室溫下避光反應30 min,6000 r/min離心10 min,取上清液于517 nm處測定吸光度,平行試驗3次。DPPH自由基清除率計算如下:

式(2)

式中:SADPPH表示樣品的DPPH自由基清除率,%;As表示2 mL樣品與2 mL DPPH溶液的吸光度;Ab表示2 mL樣品與2 mL無水乙醇的吸光度;Ac表示2 mL純水與2 mL DPPH溶液的吸光度。

1.2.4.3 羥基自由基清除能力測定 測定方法參考He等[19],并略有改進:配制9 mmo1/L的FeSO4溶液、9 mmo1/L的水楊酸-乙醇溶液和8.8 mmo1/L的H2O2溶液。取1 mL的菌懸液,依次混勻加入1 mL的FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液、H2O2溶液,于室溫下反應20 min,在510 nm處測定吸光度,平行試驗3次。羥基自由基清除率計算如下:

式(3)

式中:SAhydroxyl表示樣品的羥基自由基清除率,%;As表示樣品與混合溶液的吸光度;Ab表示以同體積純水代替H2O2溶液的混合體系的吸光度;Ac表示以同體積純水代替樣品的混合體系的吸光度。

1.3 數據處理

實驗重復3次取平均值,實驗結果以平均值±標準差表示。采用MEGA 6.0軟件構建系統發育樹,SPSS 22.0數據軟件和Excel進行統計分析和作圖,組間數據采用方差比較分析,顯著水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 形態觀察和分子鑒定

2.1.1 形態觀察 酸湯中分離出的6株菌的菌落形態見圖1。6株菌菌落為白色或乳白色圓形,表面凸起、光滑有光澤,菌落邊緣齊整,菌落直徑在0.5～2 mm。

圖1 六株分離菌的菌落形態Fig.1 Colony characteristic morphology of six strains注:a、b、c、d、e、f分別為菌株JMST-1、JMST-2、JMST-5、JMST-7、JMST-8、JMST-9;圖2同。

6株菌革蘭氏染色鏡檢結果見圖2。由圖2可知,菌株染色結果均為陽性,細胞形態為桿狀,無芽孢,單個、成對或成簇排列。菌株的過氧化氫酶實驗結果為陰性。

圖2 六株分離菌的細胞顯微形態(×10000)Fig.2 Microscopic cell morphology of six strains(×10000)

2.1.2 分子生物學鑒定 6株待測菌的16S rDNA片段PCR擴增產物的凝膠電泳圖見圖3。由圖3可見,1500 bp左右處出現熒光帶,且無明顯拖尾現象,可知PCR擴增成功。

圖3 六株分離乳酸菌PCR擴增產物電泳圖Fig.3 Electrophoresis of amplified PCR from six strains注:M:1 kb DNA Marker;1～6分別為菌株JMST-1、JMST-2、JMST-5、JMST-7、JMST-8、JMST-9。

將6株菌的 DNA送檢測序,結果在 NCBI 中GenBank進行 BLAST 分析,同時將此序列提交到 EzBioCloud數據庫,選取參考菌株進行同源性比對,各菌株與參考菌株的同源性均達到99%以上(表1)。選取適宜的參考菌株序列,使用MEGA 6.0構建系統發育樹以顯示菌株間親緣關系(圖4)。

表1 6株分離乳酸菌16S rDNA 基因序列分析結果Table 1 Homologous alignment analysis results of 16S rDNA gene sequences from six isolates

圖4 基于16S rDNA序列的6株分離菌的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of six isolates

如圖4所示,6株菌與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的菌株有較近親緣關系,且與參考菌株LactobacillusplantarumATCC 14917(ACGZ01000098) 的同源性達到99.7%以上,說明6株菌均為植物乳桿菌(L.plantarum)。植物乳桿菌是乳酸桿菌的一種,乳酸桿菌是酸湯發酵最主要的功能菌,與醋酸桿菌、明串珠菌和酵母菌等構成酸湯特有的微生物區系[3]。在酸湯發酵后期,植物乳桿菌通常繁殖成為優勢菌種,通過大量產酸縮短發酵時間,并降低酸湯中亞硝酸鹽的含量,完成乳酸發酵的終止階段[20-21]。

2.2 耐酸和耐膽鹽能力測定

2.2.1 耐酸能力測定 植物乳桿菌的生長在pH小于 4.0的環境下會受到明顯抑制[22],但酸湯中的乳酸菌需要耐受發酵過程中pH在3.0～4.0之間的波動[4]。人體胃液中胃酸的主要成分為鹽酸,其pH通常為3.0左右,在空腹情況下可達2.5,比酸湯發酵的酸度更低[23]。因此,只有少數具有良好耐酸能力的乳酸菌可以通過胃酸屏障,以活菌形式到達胃腸道并發揮作用。由于一般食物通過胃的時間低于3 h,液體通過的時間更短,本實驗用鹽酸對6株植物乳桿菌的生長環境進行調節,觀察其在pH2.5的環境下存活3 h的情況,結果如表2所示。

表2 乳酸菌對酸的耐受性(n=3)Table 2 Acid-tolerant of lactic acid bacteria(n=3)

如表2所示,在pH2.5條件下,3 h后6株植物乳桿菌的存活率范圍在88.17%～94.48%之間,活菌數保持在107CFU/mL以上。研究顯示,乳酸菌發揮益生作用的最低活菌數目為106CFU/mL[24]。本實驗6株菌在pH2.5環境下3 h后活菌數高于發揮益生作用的最低值,說明6株菌均具有良好的耐酸性。Guesh等[25]自56株益生菌中篩選出4株耐受pH2.5的乳酸菌,其存活率最低為77%,最高為91%,略低于本實驗中6株菌的存活率但相差不大,其他研究[26-28]也得到了類似結果。國內學者溫賀等[29]自酸菜中分離的1株植物乳桿菌在pH3.0的條件下存活率為55%,可見本實驗6株菌具有更強的耐酸能力,其良好的耐酸能力可能與菌體內多種生物酶參與的代謝途徑有關[30],具體機理有待進一步研究。

2.2.2 耐膽鹽能力測定 食物在經過胃液的消化后會進入十二指腸與具有抑菌作用的膽鹽接觸。膽鹽能改變細胞膜的通透性,通過破壞細胞膜的完整度造成細胞死亡[31]。因此,乳酸菌對人體胃腸道中高濃度膽鹽的耐受能力是衡量其潛在益生特性的重要指標。研究表明[32-33],小腸內膽鹽的含量范圍在 0.3%左右,一般食物通過需要1～4 h,因此本實驗選取0.3% 的膽鹽濃度對6株植物乳桿菌進行3 h培養,存活情況見表3。

如表3所示,在0.3% 膽鹽濃度下,3 h后6株菌的存活率在87.37%～92.65%之間,活菌數均維持在107CFU/mL以上,說明6株菌具有良好的膽鹽耐受性。其中JMST-1、JMST-7和JMST-9對膽鹽的耐受性較高,活菌數的對數值均保持在8以上,存活率大于91%,與Sakandar等[28]對L.plantarumATCC 14917的研究結果一致。其他學者也在相同的膽鹽濃度下對發酵蔬菜源乳酸菌進行了研究,胡斌等[31]對8 株植物乳桿菌培養2 h,菌株存活率在24.1%～91.1%之間,僅有2株菌的活菌數達到107CFU/mL;Azat等[34]的研究中,6株乳酸菌3 h后的活菌數下降到106CFU/mL?？梢钥闯?本實驗中6株菌對膽鹽的耐受性更強,可能與6株植物乳桿菌菌體中脂肪酸的構成[31]和膽鹽水解酶的數量[35]有關。

表3 乳酸菌對膽鹽的耐受性(n=3)Table 3 Bile-tolerant of lactic acid bacteria(n=3)

2.3 抗氧化能力測定

2.3.1 DPPH自由基清除能力測定 DPPH自由基清除試驗是目前乳酸菌的抗氧化研究中最常用的方法,一般使用分光光度計進行評估。本實驗以清除DPPH自由基為指標對6株菌進行抗氧化能力測定,結果如圖5所示。

圖5 乳酸菌對DPPH自由基的清除能力(n=3)Fig.5 DPPH radical scavenging activity of lactic acid bacteria(n=3)

由圖5可知,6株植物乳桿菌具有一定的DPPH自由基清除能力,清除率范圍在23.25%～34.91%之間。 其中JMST-2、JMST-7的清除率最高,分別為32.20%和34.91%。國內學者張香美等[36]對8株乳酸菌進行了同樣的測定,其結果為15%～34%;劉少敏等[37]的實驗中3株菌的清除結果在5%～17%之間。相較而言,本實驗中6株菌對DPPH自由基的清除能力更強。此外,一些學者的研究結果與本實驗相近,例如,陸婧婧等[38]得到了2株清除結果為28%和33%的乳酸菌;Das等[39]的研究中3株菌的清除結果在25%～40%之間。針對植物乳桿菌種的相關研究中,劉少敏等[37]測得L.plantarumATCC 14917的DPPH自由基清除率為16.55%,低于本實驗6株菌的清除結果;Hashemi等[40]的實驗中植物乳桿菌LS5表現出49.6%的DPPH自由基清除率,Xu等[15]的研究中清除率最大值在52%左右,均高于本實驗結果?？梢钥闯?即使同一種屬的植物乳桿菌對DPPH自由基的清除能力也不同,這或許由于菌株個體的抗氧化活性物質的含量和分布等存在差異。

2.3.2 羥基自由基清除能力測定 本實驗對6株菌體濃度為108CFU/mL的植物乳桿菌進行了羥基自由基清除能力測定,其結果如圖6所示。

圖6 乳酸菌對羥基自由基的清除能力(n=3)Fig.6 Hydroxyl radical scavenging activity of lactic acid bacteria(n=3)

由圖6可知,6株植物乳桿菌對羥基自由基有一定的清除能力。JMST-8對羥基自由基的清除能力最低,其余5株菌對羥基自由基的清除率在9%～16%之間,其中JMST-1、JMST-2的清除能力最好,分別為15.44%和14.67%。侯保朝等[41]從酸菜中篩選出3株益生特性良好的乳酸桿菌,在菌體濃度為109CFU/mL時測定其羥基自由基清除率小于5%,低于本實驗結果。在對乳酸菌的抗氧化能力測定中,本實驗6株菌的羥基自由基清除能力低于DPPH自由基清除能力,這與Das等[39]、Tang等[42]及Arasu等[43]的研究結果一致,與劉少敏等[37]和陸婧婧等[38]的研究結果不同。原因可能是不同乳酸菌中抗氧化物質存在差異,且不同物質對兩種自由基的清除效果不同。有報道顯示,乳酸菌對羥基自由基的清除機制可能與胞外多糖[44]以及發酵過程中產生的乳蛋白肽[45]等有關。

3 結論

從貴州酸湯中篩選出的6株發酵性能優良的乳酸菌,通過菌落形態觀察和16S rDNA序列相似性分析,鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。6株植物乳桿菌的耐酸、耐膽鹽能力良好,在pH2.5或0.3% 膽鹽的環境下存活率高于87%,活菌數達到107CFU/mL以上。其中JMST-1、JMST-7、JMST-9的耐受能力較好,在耐酸和耐膽鹽試驗中存活率均在90%以上,活菌數達到108CFU/mL。體外抗氧化試驗結果顯示6株菌的自由基清除能力因菌株個體差異較大。當菌體濃度為108CFU/mL時,6株菌對DPPH自由基的清除率在23%～35%之間,對羥基自由基的清除率為6%～16%。比較發現,JMST-1耐低酸和高濃度膽鹽的能力較好,且具有一定抗氧化能力,在耐酸和耐膽鹽試驗中存活率分別達到94.48%和91.09%;對DPPH和羥基自由基的清除結果分別為28.60%和15.44%。

研究結果反映了6株酸湯源植物乳桿菌的耐酸、耐膽鹽和抗氧化能力,6株菌均具有良好的耐低酸和高濃度膽鹽的能力,可以作為潛在的益生菌進行深入研究。其中JMST-1具有較好的耐酸、耐膽鹽、清除DPPH自由基和羥基自由基的能力,可作為酸湯源乳酸菌功能性食品開發的備選菌株,其潛在的益生特性和抗氧化能力有待進一步研究。