黃精總皂苷提取工藝優化及其對α淀粉酶及α葡萄糖苷酶抑制活性

包瑞敏,張 智,*,杜亞飛,高 群,王 彪,張志峰

(1.東北林業大學林學院,黑龍江哈爾濱 150040;2.秀山土家族苗族自治縣油茶研究院,重慶 409900)

黃精是百合科植物黃精、多花黃精的干燥根莖[1-2],主要化學成分有皂苷、多糖、生物堿等,具有降血糖、降血脂、增強免疫、促進睡眠等功效[3-8]。皂苷是黃精主要活性成分[9]。

目前,對黃精總皂苷的提取方法主要有有機溶劑提取法、超聲波法、微波法、酶法以及超聲波輔助纖維素酶法等[10-13],纖維素酶和果膠酶能特異性降解中草藥細胞壁中纖維素、果膠,使細胞內物質最大限度地溶出,因此,本研究選擇利用纖維素酶和果膠酶共同進行黃精總皂苷的提取,通過復合酶法的使用更大限度地提高黃精總皂苷得率。Miura等[14]利用非胰島素依賴型糖尿病小鼠研究了黃精根莖的提取物具有降血糖作用。

本研究通過黃精總皂苷提取物對α-葡萄糖苷酶及α-淀粉酶抑制活性的研究來輔助對黃精總皂苷降糖活性的研究,旨在為黃精總皂苷的提取、利用提供新的角度和一定的數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮黃精 于2018年12月采自貴州省印江縣,經貴州省中藥材產業黃精專家組龍昌順專家鑒定為百合科植物多花黃精的干燥根莖;薯蕷皂苷元標準品 上海哈靈生物科技有限公司;果膠酶(1.0×105U/g)、纖維素酶(1.4×106U/g) 北京博奧拓達科技有限公司;α-葡萄糖苷酶(100 U/mg)、α-淀粉酶(150 U/mg)、阿卡波糖 上海源葉生物科技有限公司。

UV-5500PC型紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;RT-6000型酶標儀 深圳雷杜生命科學有限公司;SJ-3 F型pH計 上海圣科儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 總皂苷提取工藝 將鮮黃精清洗切片放入干燥箱干制,取出干燥片粉碎,過60目篩后裝袋,于4 ℃保存待用。

稱取一定量上述黃精粉末,加入一定比例的纖維素酶與果膠酶,以一定料液比加入蒸餾水,調節酶解pH,在一定溫度下提取一定時間,得到黃精總皂苷提取液。

1.2.2 單因素試驗

1.2.2.1 纖維素酶添加量對得率的影響 在果膠酶添加量3.0%,料液比1∶12 g/mL,調節酶解pH為5.0,40 ℃酶解溫度下,調整纖維素酶添加量為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%,酶解1.5 h后迅速升溫至90 ℃以上,保持15 min使酶失活。室溫下離心,用100 mL蒸餾水洗滌濾渣,合并濾液濃縮至100 mL。精密吸取20 mL,用水飽和的正丁醇萃取3次,合并正丁醇部分,冷凍干燥,得粗黃精總皂苷。將粗皂苷用甲醇定容至50 mL,制成樣品液,測定樣品液的總皂苷含量。

1.2.2.2 果膠酶添加量對得率的影響 確定纖維素酶添加量0.4%,其他條件同上,調整果酶添加量為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%,測定樣品液的總皂苷含量。

1.2.2.3 料液比對得率的影響 確定纖維素酶添加量0.4%,果膠酶添加量5.0%,其他條件同上,調整料液比為1∶4、1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24 g/mL,測定樣品液的總皂苷含量。

1.2.2.4 酶解pH對得率的影響 確定纖維素酶添加量0.4%,果膠酶添加量5.0%,料液比1∶16 g/mL,其他條件同上,調整酶解pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5,測定樣品液的總皂苷含量。

1.2.2.5 酶解溫度對得率的影響 確定纖維素酶添加量0.4%,果膠酶添加量5.0%,料液比1∶16 g/mL,酶解pH為5.0,其他條件同上,調整酶解溫度為30、35、40、45、50、55 ℃,測定樣品液的總皂苷含量。

1.2.2.6 酶解時間對得率的影響 確定纖維素酶添加量0.4%,果膠酶添加量5.0%,料液比1∶16 g/mL,酶解pH為5.0,酶解溫度為45 ℃,調整酶解時間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h,測定樣品液總皂苷含量。

1.2.3 響應面試驗 根據單因素實驗結果選擇纖維素酶添加量、酶解溫度、酶解時間3個因素,以黃精總皂苷得率為指標,設計3因素3水平響應面試驗,如表1所示。

表1 響應面因素水平表Table 1 Factors and levels response surface method

1.2.4 總皂苷得率的計算

1.2.4.1 標曲的制作 參考苑璐等[15]的方法稍作改動,使用薯蕷皂苷元作為標準品,確定最大吸收波長為550 nm,繪制標準曲線。得到回歸方程為y=0.0121x+0.0034,R2=0.9997。

1.2.4.2 總皂苷得率的計算

式中:W表示總皂苷得率,%;c表示溶液質量濃度,μg/mL;D表示稀釋倍數,10-6;V表示皂苷稀釋后體積,mL;m表示黃精稱取量,g。

1.3 體外α-葡萄糖苷酶抑制活性及α-淀粉酶抑制活性研究

1.3.1α-葡萄糖苷酶抑制試驗 參考Nguyen等[16]的方法稍作改動,將50 μL不同濃度(0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、3.000 mg/mL)的樣品溶液(50% DMSO)加入到100 μL 0.1 mol/L含有α-葡萄糖苷酶溶液(1.0 U/mL)的磷酸鹽緩沖液(pH6.9)中,96孔板中25 ℃孵育10 min,對照品使用50 μL 50% DMSO替代樣品。預孵育后,將50 μL 5 mmol/L對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖溶液加入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH6.9)中。混合物在25 ℃孵育5 min。孵育前后,用酶標儀記錄405 nm處的吸光度讀數。設置0.5 mg/mL 的阿卡波糖液為陽性對照。抑制率計算如下:

式中:Acontrol表示對照樣品吸光度;Asample表示測試樣品吸光度。

1.3.2α-淀粉酶抑制試驗 參考Agu等[17]的方法稍作改動,準備200 μL不同濃度(0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、3.000 mg/mL)的樣品稀釋液和500 μL含豬源胰腺α-淀粉酶(0.50 mg/mL)磷酸鈉緩沖液(0.02 mol/dm3,pH=6.9和0.006 mol/L NaCl為穩定劑)。將樣品在37 ℃下孵育5 min,然后將500 μL淀粉溶液(1 mg/100 mL,0.02 mol/dm3鈉緩沖液,pH6.9,含0.006 mol/L NaCl引入反應混合物中。并在37 ℃水浴中孵育5 min。加入1 mL二硝基水楊酸(DNSA)停止反應,然后在沸水中進一步孵育5 min。空白樣品中不添加淀粉溶液和酶,而對照樣品除淀粉溶液外,所有試劑和酶都有。當反應混合物冷卻時,在540 nm處讀取吸光度。設置0.5 mg/mL 的阿卡波糖液為陽性對照。抑制率計算如下:

式中:Acontrol表示對照樣品吸光度;Asample表示測試樣品吸光度。

1.4 數據處理

數據使用平均值±標準差表示,每組數據測定3次,采用Excel 2019處理,圖表使用OrginLab繪制,響應面方案的設計及分析使用Design Expert 10進行。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 纖維素酶添加量對得率的影響 由圖1可知,纖維素酶添加量0.4%時,黃精總皂苷得率最大,這可能是由于纖維素酶可以產生破壁作用致使皂苷類化合物充分溶出。之后,增加纖維素酶含量,得率則持續下降,可能是因為過高的酶含量會造成皂苷的降解[18]。據此,纖維素酶添加量確定為0.4%。

圖1 纖維素酶添加量對得率的影響Fig.1 Effect of cellulase addition on extraction rate

2.1.2 果膠酶添加量對得率的影響 由圖2可知,果膠酶添加量由1.0%增加到5.0%的過程中,黃精總皂苷得率不斷增大,果膠酶添加量5.0%時得率最大。而后,總皂苷得率呈現降低趨勢。這種變化可能因為果膠酶能夠降解植物細胞細胞壁,隨著添加量增加,活性成分不斷溶出,然而,酶含量的增加并沒有使得率持續上高,可能是因為過高的酶含量會造成皂苷的降解。據此,果膠酶添加量選擇為5.0%。

圖2 果膠酶添加量對得率的影響Fig.2 Effect of pectinase addition on extraction rate

2.1.3 料液比對得率的影響 由圖3可知,隨著料液比的減小黃精總皂苷得率不斷增大,料液比為1∶16 g/mL時得率最大。這種變化可能是過少的蒸餾水在提取時會導致提取液較為粘稠,目標物釋放困難,會出現提取速度慢、提取不完全的情況。當蒸餾水的用量不斷增加,酶與反應物能夠增大接觸面積,致使溶液中的總皂苷含量增多。據此,選擇料液比為1∶16 g/mL。

圖3 料液比對得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate

2.1.4 酶解pH對得率的影響 由圖4可知,pH4.0～5.0時,黃精總皂苷得率呈遞增趨勢,pH為5.0時得率最大,pH超過5.0后,得率呈遞減趨勢,說明pH為5.0時最有利于酶和底物的結合,由此得出:過低與過高的pH均能使酶的活性降低,而此復合酶的最適pH為5.0。據此,選擇pH為5.0。

圖4 酶解pH對得率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis pH on extraction rate

2.1.5 酶解溫度對得率的影響 由圖5可知,當酶解溫度低于35 ℃時黃精總皂苷得率處于較低的狀態,而當溫度超過35 ℃后酶解速度增加,得率出現較大地上升,并在45 ℃時達到最大。超過45 ℃后酶活性降低,酶解速度減慢,得率降低。這可能是由于低溫時分子運動弱,酶與底物的結合率低,反應速率低。隨著酶解溫度的升高,反應物分子間的有效碰撞次數增多,反應速率提升。但過低與過高的溫度均不利于酶解的進行,而45 ℃正是此復合酶最適溫度。據此,綜合考慮,選擇酶解溫度為45 ℃。

圖5 酶解溫度對得率的影響Fig.5 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on extraction rate

2.1.6 酶解時間對得率的影響 由圖6可知,隨著酶解時間的加長黃精總皂苷得率隨之上升,酶解時長2.0 h時得率最大,而后延長酶解時間得率稍有降低。酶解反應需要一定時間,酶解時間的加長能夠使酶與底物充分反應,當酶解結束,酶解時間的加長沒有讓總皂苷得率持續升高。因此,選擇酶解時間為2.0 h。

圖6 酶解時間對得率的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time on extraction rate

2.2 響應面試驗結果與方差分析

根據單因素實驗結果確定響應面設計方案,得率結果如表2所示,回歸方程為Y=-29.07+17.76A+1.19B+3.21C+0.016AB+0.668AC+0.075BC-24.16A2-0.015B2-1.79C2,響應面模型方差分析如表3所示。

表3 響應面模型方差分析Table 3 Anovariance analysis of response surface model

由表3可以看出,黃精總皂苷提取工藝的回歸模型P=0.0001<0.01,說明回歸模型達到極顯著,具有統計學意義;模型誤差失擬項P=0.1262>0.05,差異不顯著,R2=0.9729,表明該方程對模型擬合情況較好,能夠反映纖維素酶添加量、酶解溫度、酶解時間對黃精總皂苷得率的影響,可用來分析和預測黃精總皂苷得率。

經Design-Expert 10. 0軟件處理得到個因素交互作用的響應面圖(圖7～圖9),可以直觀地看出各因素間的交互作用對黃精總皂苷得率的影響,可以看出每兩個因素之間具有一定的交互作用但不明顯,圖7等高線呈現橢圓形,纖維素酶添加量軸向等高線變化密集,對響應值峰值的影響較酶解溫度大。圖8等高線呈現橢圓形,纖維素酶添加量對響應值峰值的影響較酶解時間大。圖9酶解溫度和酶解時間軸向等高線變化密集程度相當,說明二者對響應值峰值的影響相當,但都比纖維素酶添加量小。

圖7 纖維素酶添加量與酶解溫度交互作用效應Fig.7 Interaction effect of cellulase addition amount and enzymatic hydrolysis temperature

圖8 纖維素酶添加量與酶解時間交互作用效應Fig.8 Interaction effect of cellulase addition amount and digestion time

圖9 酶解溫度與酶解時間交互作用效應Fig.9 Interaction effect of enzymatic hydrolysis temperature and enzymatic hydrolysis time

經Design-Expert. 10. 0軟件分析,得出黃精總皂苷最佳提取工藝條件為:纖維素酶添加量0.41%,酶解溫度44.3 ℃,酶解時間為1.9 h,此時理論上的預測得率為4.04%。考慮到操作的實際性,將最佳參數設置為纖維素酶添加量0.4%,酶解溫度45 ℃,酶解時間2.0 h進行驗證試驗,重復3次,驗證結果的可靠性,測得皂苷得率為4.06%,與理論預測值非常相近,由此,基于響應曲面法所得的黃精總皂苷提取參數準確可靠,具有實用價值。

2.3 黃精總皂苷體外α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶抑制活性

使用上文所獲得的最佳提取條件提取的黃精總皂苷,分別驗證不同的總皂苷濃度對α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制率。

黃精總皂苷對α-葡萄糖苷酶抑制率如圖10所示。α-葡萄糖苷酶可以將二糖消化為葡萄糖,其位于腸道細胞表面膜上,對于II型糖尿病患者來說,餐后,α-葡萄糖苷酶的作用極易造成高血糖[19]。若能抑制寡糖水解成葡萄糖的過程,就可控制餐后高血糖。因此,抑制α-葡萄糖苷酶活性從而抑制糖類水解,有利于II型糖尿病患者控制血糖[20]。不同濃度的黃精總皂苷對α-葡萄糖苷酶均有抑制作用,陸建美等[21]的研究也得到相近的結果。抑制率隨其濃度的升高而增大,在總皂苷濃度低于0.500 mg/mL時,其抑制率較低,在0.500 mg/mL其抑制率達到61%,當濃度高于0.500 mg/mL后抑制率的上升則相對放緩。當濃度為3.000 mg/mL 時,抑制率為74%,接近于阿卡波糖(0.5 mg/mL)的82%。

圖10 黃精總皂苷對α-葡萄糖苷酶的抑制率Fig.10 Inhibitory rate of Polygonatum sibirium saponins on α-glucosidase

黃精總皂苷對α-淀粉酶抑制率如圖11所示。α-淀粉酶可以水解淀粉內部的α-1,4-糖苷鍵,水解產物為糊精、低聚糖和單糖,也可以造成胰島素代謝障礙人群餐后高血糖[22]。黃精總皂苷對α-淀粉酶抑制率整體趨勢隨濃度的增大而增強,在總皂苷濃度低于1.000 mg/mL,其α-淀粉酶抑制率增加較為明顯,隨后增長趨勢放緩。2.000 mg/mL時,其抑制率最高,達到82%,高于阿卡波糖(0.5 mg/mL)的80%。兩組酶抑制試驗說明黃精總皂苷提取物具有抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的作用。

圖11 黃精總皂苷對α-淀粉酶的抑制率Fig.11 Inhibitory rate of saponins from Polygonatum sibiricum on α-amylase

3 結論

本文以黃精為原料,對黃精總皂苷的復合酶法提取工藝及總皂苷對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性進行了研究,在單因素實驗的基礎上通過響應面優化試驗確定出最佳提取參數:纖維素酶添加量0.4%,果膠酶添加量5.0%,料液比1∶16 g/mL,酶解pH為5.0,酶解溫度45 ℃,酶解時間2.0 h,在此條件下得率為4.06%。分別測試不同濃度下的黃精總皂苷體外α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶抑制活性,兩組酶的抑制試驗說明:黃精總皂苷具有抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的作用,表明其具有一定的降血糖功能。本文為黃精這一傳統的藥食同源性中草藥植物能夠被更好地開發、利用提供有效的理論參考。在今后的研究中,可結合總皂苷體外降糖試驗與體內降糖試驗兩方面完善其降糖功能的探究。