乳清分離蛋白酶解制備抗氧化和ACE抑制活性產(chǎn)物

歐 凱,王開祥

(杭州娃哈哈科技有限公司,浙江省食品生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310018)

人體常規(guī)代謝產(chǎn)生的自由基會攻擊生命大分子而造成組織細(xì)胞損傷,是引起機(jī)體衰老和誘發(fā)腫瘤等惡性疾病的重要原因[1]。一些多肽、氨基酸可以清除自由基,在一定程度上消除機(jī)體內(nèi)多種生理功能障礙,延緩機(jī)體的衰老,減少各種老年性疾病的發(fā)生[2]。高血壓是一種常見的心血管疾病。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin-converting enzyme,ACE)在人體心血管系統(tǒng)中起重要作用,可通過刺激血管收縮和抑制血管舒張使血壓升高[3]。研究表明,食源性ACE抑制活性肽可以抑制ACE的活性而起到降血壓的作用[4]。

乳清蛋白富含必需氨基酸,易消化吸收,是一類營養(yǎng)價值較高的優(yōu)質(zhì)蛋白,素有蛋白質(zhì)之王”之稱[5]。研究發(fā)現(xiàn),乳清蛋白通過酶解可以獲得多種生物活性,例如抗氧化[6]、ACE抑制活性[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]等。李朝慧等[9]采用5種蛋白酶分別酶解乳清蛋白。結(jié)果表明,堿性蛋白酶水解物的ACE抑制率最大,為90.68%。Wang等[10]對乳清分離蛋白進(jìn)行單酶(alcalase、trypsin和neutrase)和復(fù)合酶酶解(alcalase-neutrase),結(jié)果表明,在pH自然下降的條件下,與單酶水解相比,復(fù)合酶(alcalase-neutrase)酶解乳清分離蛋白得到的產(chǎn)物ACE抑制能力較高(P<0.05),抑制率為54.30%。任嬌艷等[11]用堿性蛋白酶制備乳清肽,抗氧化活性較高的肽段分子質(zhì)量集中在300～700 Da。沈浥等[12]用不同蛋白酶酶解乳清濃縮蛋白,胰蛋白酶效果最好,DPPH自由基清除率IC50為5.52 mg/mL,產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量分布在300～2600 Da,主要分布在1000 Da以下。

在實(shí)際生產(chǎn)過程中,采用兩種及以上復(fù)合蛋白酶同時作用乳清蛋白,不僅可以提高酶解效率,在一定程度上還可修飾苦味肽,減少產(chǎn)品苦味[4]。本研究采用復(fù)合酶分步水解乳清分離蛋白,考察復(fù)合酶水解條件對乳清蛋白在酶解過程中的水解度、肽濃度、游離氨基酸含量等的影響,并對酶解物的抗氧化活性和ACE抑制活性進(jìn)行分析,以期為乳清蛋白在功能食品和保健品中的開發(fā)利用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清分離蛋白(WPI,蛋白含量95%) 美國Agropur公司;堿性蛋白酶Alkaline(58萬DU/g) 美國丹尼斯克公司;中性蛋白酶Maxipro NPU(18萬PC/g) 荷蘭帝斯曼公司;肽酶Prote AX(1630 U/g) 日本天野公司;風(fēng)味蛋白酶Flavourzyme 1000 L(1000 L APU/g) 丹麥諾維信公司;血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin-converting enzyme,ACE)、馬尿酰組氨酰亮氨酸(N-Hippuryl-His-Leu,HHL)、馬尿酸、ABTS、Trolox、OPA、SDS、β-巰基乙醇、絲氨酸、四肽Gly-Gly-Tyr-Arg Sigma公司。

L-8900氨基酸自動分析儀 日本HITACHI公司;2695高效液相色譜儀 美國Waters公司;Lambda35紫外可見分光光度計(jì) 美國PerkinElmer公司;DK-S24恒溫水浴鍋 上海精宏公司;5810R離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳清蛋白活性肽的制備 稱取一定質(zhì)量的WPI,溶解于50 ℃去離子水中,配制一定濃度的底物溶液(w/w),調(diào)節(jié)高速剪切乳化機(jī)2000 r/min水化30 min后,置于恒溫水浴鍋中,按適宜的酶與底物比([E/S])加入蛋白酶,酶解一定時間后,95 ℃滅酶 10 min,得到乳清蛋白酶解物。

1.2.2 蛋白酶特性的研究 采用1.2.1的酶解方法,底物濃度5%,[E/S]1%,pH自然,溫度50 ℃,酶解21 h,測定不同酶酶解后,水解液的水解度、肽濃度及17種游離氨基酸含量。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 用堿性蛋白酶Alkaline進(jìn)行酶解。

1.2.3.1 最適溫度測定 底物濃度5%,[E/S]1%,起始pH8.5,料液溫度分別恒溫至40、45、50、55、60、65 ℃,酶解10 min,測定肽濃度。

1.2.3.2 最適pH測定 底物濃度5%,[E/S]1%,溫度55 ℃,酶解過程分別維持pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5,酶解10 min,測定肽濃度。

1.2.3.3 最適底物濃度測定 溫度55 ℃,酶解過程維持pH8.5,[E/S]1%,底物濃度5%、7%、9%,考察120 min內(nèi)肽濃度變化。

1.2.3.4 最適[E/S]測定 溫度55 ℃,維持pH8.5,底物濃度7%,[E/S]分別為0.5%、1.0%、1.5%,考察120 min內(nèi)肽濃度變化。

1.2.4 復(fù)合酶分步酶解實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 分步酶解酶種類確定 溫度55 ℃,起始pH8.5,底物濃度7%,起始加1% Alkaline([E/S]),60 min后分別加1% Alkaline、AX、NPU([E/S]),120 min后加1% Flavourzyme([E/S]),考察180 min酶解過程水解度和肽濃度變化。

1.2.4.2 NPU添加時間實(shí)驗(yàn) 溫度55 ℃,pH自然,底物濃度7%,1.5% Alkaline([E/S]),分別在0、60、120 min添加1% NPU([E/S]),考察酶解過程肽濃度變化。

1.2.4.3 Flavourzyme添加時間實(shí)驗(yàn) 溫度55 ℃,底物濃度7%,酶解前10 min控pH8.5,起始加1.5% Alkaline([E/S]),pH降至7.2后加1% NPU([E/S]),分別于100、140、180、210 min添加1% Flavourzyme([E/S]),考察肽濃度及感官風(fēng)味變化。

1.2.4.4 復(fù)合酶分布酶解工藝確定 溫度55 ℃,底物濃度7%,酶解前10 min控制pH8.5,起始加1.5% Alkaline([E/S]),pH降至7.2后加1% NPU([E/S]),酶解240 min后加1% Flavourzyme([E/S]),繼續(xù)酶解20 min后滅酶,對酶解物的肽濃度、ACE抑制活性、ABTS自由基清除活性、分子量分布及游離氨基酸含量進(jìn)行測定。

1.2.5 酶解液感官分析 參照任國譜等[13]方法,酶解液用純凈水稀釋至1%蛋白濃度,7人品嘗打分,然后與異味等級相對應(yīng)。異味等級分為5級,分別表示為無(0)、輕微(1)、較重(2)、重(3)和嚴(yán)重(4)。

1.2.6 水解度測定 OPA法,參照Nielsen等[14]方法適當(dāng)改進(jìn):取5 mL酶解液加入5 mL 10% SDS溶液,振蕩混勻。超純水稀釋25倍后,300 μL樣品加入3 mL現(xiàn)配OPA試劑,室溫精確反應(yīng)3 min,于340 nm測定吸光度值。300 μL超純水為試劑空白。以絲氨酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線,吸光度值y與絲氨基濃度(mmol/L)x的關(guān)系為y=0.5848x+0.0006,R2=0.9999,計(jì)算樣品中自由氨基,再根據(jù)公式計(jì)算水解度DH:

h=(serine-NH2-β)/αmmol/g protein

式中:h是絲氨酸氨基毫摩爾數(shù)的函數(shù)。htot、α、β取決于原料類型。乳清蛋白htot=8.8 mmol/g protein,α=1.00,β=0.40。

1.2.7 氨基酸含量測定 參照GB 5009.124-2016[15]。儀器:L-8900,色譜柱:4.6×60 mm(填料2622),柱溫:57 ℃,反應(yīng)器溫度:134 ℃,泵1:0.350 mL/min,泵2:0.30 mL/min,進(jìn)樣體積:20 μL,檢測波長VIS1:570 nm;VIS2:440 nm。

1.2.8 肽濃度測定 雙縮脲法[16]適當(dāng)改進(jìn):取酶解液500 μL,加入等體積20%三氯乙酸離心后,取上清700 μL,加入5% NaOH 600 μL,2%酒石酸鉀鈉500 μL,超純水1 mL,混合均勻;測定前加入1%硫酸銅溶液700 μL,混合均勻后室溫避光反應(yīng)10 min,于545 nm測吸光度值。以四肽Gly-Gly-Tyr-Arg做標(biāo)準(zhǔn)曲線,吸光度值y與肽濃度(mg/mL)x的關(guān)系為y=0.06114x+0.00835,R2=0.9993,根據(jù)標(biāo)曲計(jì)算樣品中肽含量。

1.2.9 分子量分布 參照GB/T 22492-2008[17]。2 mL樣品,用流動相稀釋5倍,離心過濾后測定。儀器:Waters 2695,色譜柱:TSK-GEL G2000SWXL(7.8×300 mm),流動相:乙腈∶水∶三氟乙酸=20∶80∶0.1(v/v),柱溫:室溫,流速:0.5 mL/min,進(jìn)樣量:20 μL,檢測波長:220 nm,檢測器:Waters 2998 PDA。

1.2.10 抗氧化活性測定 采用ABTS自由基清除率表征酶解物的抗氧化活性,參照Ewelina等[18]方法操作:酶解過程取樣稀釋至2 mg/mL蛋白濃度后測定。40 μL樣品,加入960 μL ABTS自由基試劑(吸光度為0.7±0.02),734 nm測定吸光度值。超純水作空白對照,Trolox作陽性對照。以Trolox做標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算IC50Trolox當(dāng)量。ABTS自由基清除率y(%)與Trolox濃度(μmol/L)x的關(guān)系為y=0.12974x+0.15726,R2=0.9991。

式中:A為空白組吸光值;B為樣品吸光值。

1.2.11 ACE抑制活性測定 參照Nakamura等[19]方法改進(jìn)。酶解過程取樣稀釋至2 mg/mL蛋白濃度后測定。ACE、HHL均用0.1 mol/L硼酸-硼砂緩沖液配制(pH8.3,含0.3 mol/L NaCl);10 μL ACE(0.1 U/mL),加樣品20 μL,37 ℃溫育5 min后加入100 μL HHL(6.5 mmol/L),37 ℃反應(yīng)30 min后,加入170 μL 1.0 mol/L HCl終止反應(yīng)。空白用20 μL硼酸-硼砂緩沖液替代樣品。反應(yīng)液膜過濾后用HPLC測定馬尿酸含量。儀器:Waters 2695,色譜柱:C18(4.6×250 mm,5 μm),流動相:水(0.1% TFA):乙腈(0.1% TFA)=75:25,柱溫:30 ℃,進(jìn)樣量:20 μL,檢測波長:228 nm。

式中:A:空白組中馬尿酸的含量(mg/mL);B:樣品組中馬尿酸的含量(mg/mL)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各組數(shù)據(jù)均為3次測定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差,不同樣品間的差異采用單因素方差分析進(jìn)行比較,以P<0.05為有顯著性。采用Minitab 17進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,采用Origin 9.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶特性的研究

堿性蛋白酶Alkaline、中性蛋白酶NPU、肽酶AX和風(fēng)味酶Flavourzyme酶解物的水解度、肽濃度、氨基酸總量及17種氨基酸含量占比結(jié)果如表1所示。Alkaline酶解物中的肽濃度顯著高于其他三種蛋白酶(P<0.05),水解度和游離氨基酸總量顯著低于Flavourzyme(P<0.05)。因此,從肽濃度的結(jié)果來看,Alkaline應(yīng)作為以肽為主要產(chǎn)物的酶解用酶,其他3種酶可作為酶解輔助酶。Flavourzyme酶解物的水解度和游離氨基酸含量顯著高于NPU和AX(P<0.05),但是肽濃度顯著低于NPU和AX(P<0.05)。且Flavourzyme酶解物的游離氨基酸中,疏水性氨基酸如亮氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和纈氨酸等占比較高。陶紅等[20]研究發(fā)現(xiàn)游離的疏水性氨基酸不產(chǎn)生苦味,采用外切酶可有效減少水解液的苦味。如表1所示,WPI原料中含有較高含量的疏水性氨基酸。張亞南[21]對乳清苦味肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,發(fā)現(xiàn)乳清具有苦味主要是由于疏水性氨基酸導(dǎo)致。因此,綜合肽濃度、游離氨基酸含量和水解度結(jié)果來看,Flavourzyme在以肽為主要產(chǎn)物酶解過程中比較適合在酶解結(jié)束前加入,用于風(fēng)味修飾。

表1 不同酶解物及WPI的水解度、肽濃度、氨基酸含量Table 1 The DH,peptide concentration,amino acid content of different hydrolysates and WPI

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

圖1A和1B所示,堿性蛋白酶Alkaline最適溫度為55 ℃,最適pH為8.5。加入Alkaline后,pH逐步下降,且酶解起始10 min內(nèi)pH下降幅度最大,為了維持Alkaline的最適pH范圍需要不斷加入NaOH,NaOH的大量加入導(dǎo)致酶解物風(fēng)味和品質(zhì)的下降和NaCl的大量積累[10]。因此,綜合風(fēng)味、生產(chǎn)可行性、鹽積累等因素,Alkaline 僅維持最適pH 10 min,隨后pH自然下降酶解。圖1C所示,底物濃度由5%升高至9%時,肽濃度顯著升高(P<0.05)。120 min時,測得底物濃度為5%、7%、9%時肽濃度分別為41.57、57.18、62.84 g/L。對應(yīng)的底物轉(zhuǎn)化率(肽濃度/底物濃度)分別為:83.14%、81.69%、69.82%;從經(jīng)濟(jì)角度考慮,7%為最適底物濃度。圖1D所示,[E/S]由0.5%升高至1.5%,肽濃度隨之升高。120 min時,測得[E/S]為0.5%、1.0%、1.5%時肽濃度分別為43.49、56.27、61.29 g/L。考慮成本因素,堿性蛋白酶最終選擇[E/S]為1.5%。

圖1 溫度、pH、底物濃度及[E/S]的篩選Fig.1 The selection of the optimal temperature,pH,substrate concentration and alkaline dosage注:A～D分別表示:酶解溫度、pH、底物濃度、[E/S]對酶解液中肽濃度的影響。

2.3 復(fù)合酶分步酶解結(jié)果

分步加入不同酶對于肽濃度和水解度的影響如圖2A和2B所示,起始加入Alkaline,肽濃度和水解度都上升;在60 min分別加入Alkaline、AX和NPU,肽濃度繼續(xù)上升,在120 min酶解物中的肽濃度分別為43、42、47 g/L,補(bǔ)加NPU與補(bǔ)加Alkaline或AX相比可顯著提高肽濃度(P<0.05),因此,NPU可做為Alkaline酶解乳清蛋白的輔助用酶進(jìn)一步研究。在120 min加Flavourzyme,與未加前相比,雖然水解度顯著升高(P<0.05),但對肽濃度無顯著影響(P>0.05)。

由圖2C可見,添加NPU可提高肽濃度,但添加時間對肽濃度無顯著影響(P>0.05)。因此,堿性酶Alkaline控制pH8.5酶解10 min后,pH自然下降至7.2左右,開始添加中性酶NPU。

圖2 復(fù)合酶分步酶解Fig.2 The three-step-hydrolysis of composite protease注:A～B分別表示分步加酶對水解度、肽濃度的影響;C～D分別表示NPU添加時間、Flavourzyme添加時間對肽濃度的影響。

圖2D可見,在酶解不同時間分別加入Flavourzyme,對肽濃度影響不同,在100 min加入可顯著提高肽濃度(P<0.05)。而140、180和210 min加入則無顯著影響(P>0.05)。同時對加入Flavourzyme后對酶解物風(fēng)味影響進(jìn)行了評價。如表2所示,加入酶20 min后,苦味和鮮味最弱。但隨著作用時間的延長,酶解物的鮮味逐漸加重,苦味也慢慢增強(qiáng)。因此,綜合肽濃度和風(fēng)味的影響。選擇在酶解結(jié)束前加入Flavourzyme作用20 min。

表2 風(fēng)味酶處理時間對酶解液苦味和鮮味的影響Table 2 The effect of flavourzyme treatment time on the bitterness and umami of hydrolysates

綜合單因素實(shí)驗(yàn)及復(fù)合酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定最終酶解工藝為:底物濃度7%,溫度55 ℃,起始pH8.5,1.5% Alkaline([E/S]),控制pH8.5維持10 min后pH自然下降,至pH7.2后添加1% NPU([E/S]),酶解240 min,再添加1% Flavourzyme([E/S])繼續(xù)酶解20 min,滅酶。

2.4 酶解物的游離氨基酸含量和分子量分布

圖3可見,堿性酶和中性酶共同酶解240 min,游離氨基酸中酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸積累最多,主要是由于這兩種酶酶切位點(diǎn)特性所致[22]。加入風(fēng)味酶作用20 min后,總游離氨基酸含量由240 min時的2462 mg/kg上升至4348 mg/kg,與前240 min對比,半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、精氨酸含量顯著增加(P<0.05)。霍永久等[23]利用風(fēng)味酶酶解蛋清獲得的酶解物中,游離氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)44%以上,風(fēng)味酶可以在短時間內(nèi)將堿性蛋白酶和中性蛋白酶酶解后暴露的疏水氨基酸切下(亮、異亮、苯丙氨酸等),使得肽段疏水值大幅度下降[22],酶解液苦味迅速降低;酶解物中游離出來的苦味氨基酸(亮、異亮、苯丙、精、賴氨酸等)濃度增加,超過閾值[24]后逐步體現(xiàn)出苦味,但游離氨基酸苦味遠(yuǎn)低于苦味肽苦味,所以后期苦味又緩慢增強(qiáng)。這就解釋了表2風(fēng)味酶添加時間表現(xiàn)出的感官苦味變化現(xiàn)象。

圖3 游離氨基酸含量和分布Fig.3 Content and distribution of free amino acid注:*代表組間差異顯著(P<0.05)。

圖4可見,風(fēng)味酶處理20 min對肽分子量分布無顯著影響(P>0.05),酶解液中肽段主要以小于1 kDa短肽為主(69.62%),1～3 kDa占16.08%。付學(xué)軍等[25]用堿性蛋白酶酶解乳清蛋白,測得乳清肽分子量主要集中在3 kDa以下,小于1 kDa占82.25%。石丹等[26]用堿性蛋白酶酶解乳清蛋白所得酶解產(chǎn)物主要是分子質(zhì)量在 0.2～2 kDa的多肽。

圖4 肽分子量分布Fig.4 Peptide molecular weight distribution注:不同字母代表樣品間顯著差異(P<0.05)。

2.5 酶解物的ABTS自由基清除率和ACE抑制活性

圖5A所示,酶解30 min肽濃度迅速上升,ABTS自由基清除能力及ACE抑制活性也迅速上升;酶解60 min后,肽濃度上升緩慢,抗氧化和ACE抑制活性也趨于平緩;酶解末期添加風(fēng)味酶處理20 min,對生物活性無顯著影響(P>0.05)。酶解結(jié)束(260 min),肽濃度60 g/L以上。整個酶解過程ABTS自由基清除率及ACE抑制率與肽濃度高度相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.989、0.970。田俊英等[27]用胰蛋白酶水解乳清蛋白研究發(fā)現(xiàn),酶解過程肽產(chǎn)量和ACE抑制率間無相關(guān)性,可能是選用的酶及酶解工藝不同導(dǎo)致。

圖5 ABTS自由基清除率與ACE抑制活性Fig.5 The ABTS radical-scavenging activity and ACE inhibitory activity注:A表示:酶解過程中肽濃度、ABTS自由基清除率 (2 mg/mL蛋白濃度)及ACE抑制活性 (2 mg/mL蛋白濃度)變化;B表示:不同肽濃度下 ABTS自由基清除率及ACE抑制活性變化。

圖5B可見,隨肽濃度上升,抗氧化和ACE抑制活性上升,但非線性變化。多項(xiàng)式擬合計(jì)算出ABTS自由基清除活性IC50為1.02 mg/mL,相同測試條件下?lián)Q算為Trolox當(dāng)量為0.377 μmol Trolox當(dāng)量/mg。乳清是制備抗氧化肽的良好來源[28]。孫敏等[29]利用中性蛋白酶酶解乳清蛋白獲得抗氧化肽具有ABTS+自由基清除能力,IC50值為0.709 mg/mL。本樣品ACE抑制活性IC50為1.38 mg/mL。于曉慶等[30]用蛋白酶A酶解酪蛋白制備乳源ACE抑制肽,IC50為1.2063 mg/mL。Jeewanthi等[31]用分光光度法測試不同酶處理乳清蛋白過程中的ACE抑制活性變化,IC50為0.099～0.972 mg/mL。Li等[32]從發(fā)酵乳中分離出ACE抑制肽,測試IC50為77～201 μmol/L。自制樣品還有較大優(yōu)化空間,后期將進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié)論

堿性蛋白酶Alkaline、中性蛋白酶NPU、肽酶AX和風(fēng)味酶Flavourzyme酶解物的水解度、肽濃度、氨基酸總量及17種氨基酸含量占比結(jié)果表明,Alkaline可用于以肽為主要產(chǎn)物的乳清蛋白酶解用酶,AX和NPU可作為輔助用酶,Flavourzyme可用于風(fēng)味修飾。堿性酶Alkaline最適酶解條件為溫度55 ℃,pH8.5,[E/S]1.5%,底物濃度7%;復(fù)合酶酶解工藝為Alkaline酶解10 min內(nèi)控制pH8.5,pH降至7.2后添加1%中性酶NPU([E/S]);風(fēng)味酶Flavourzyme在酶解240 min后加入,[E/S]1%,繼續(xù)酶解20 min后滅酶;在此條件下,酶解物中游離氨基酸總量4348 mg/kg,肽濃度60 g/L以上,肽段主要以小于1 kDa短肽為主(69.62%);ABTS自由基清除率IC50為1.02 mg/mL,換算為Trolox當(dāng)量為0.377 μmol Trolox當(dāng)量/mg;ACE抑制活性IC50為1.38 mg/mL。研究結(jié)果顯示,以復(fù)合酶酶解乳清蛋白,產(chǎn)物具有抗氧化和ACE抑制活性,具有開發(fā)成功能食品或保健品的潛力。后續(xù)將進(jìn)一步對肽段進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及動物實(shí)驗(yàn)或人體試食研究功效機(jī)理及量效關(guān)系等,為乳清蛋白酶解物產(chǎn)品開發(fā)打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。