酶解法制備條滸苔抗氧化肽工藝優(yōu)化及其消化穩(wěn)定性研究

王 熙,劉曉攀,劉 冰,趙 行,趙永慧,盤賽昆,2,3,*

(1.江蘇海洋大學海洋生命與水產(chǎn)學院,江蘇連云港 222005;2.江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇海洋大學,江蘇連云港 222005;3.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院,江蘇連云港 222005)

滸苔(Enteromorphaspp.)在分類學上屬于綠藻門(Chlorophyta)、綠藻綱(Chlorophyceae)、石莼目(Ulvales)、石莼科(Ulvaceae),其廣泛的分布在全世界各大海洋中,生長在潮間帶巖石上,泥沙的石礫上[1]。滸苔雖無毒,但大量繁殖容易爆發(fā)綠潮災(zāi)害,影響海底藻類生長,分泌的化學物質(zhì)可能還會對海洋生物造成不利影響,破化海洋生態(tài)系統(tǒng),嚴重威脅沿海漁業(yè)和旅游業(yè)的發(fā)展[2]。

吉宏武等[3]研究表明,滸苔是一種具有很高利用價值的藻類,營養(yǎng)成分豐富,蛋白質(zhì)27%、多糖53.7%、礦物質(zhì)8.20%、脂肪0.90%,粗纖維10.20%;蛋白質(zhì)中氨基酸種類齊全,必需氨基酸占氨基酸總量的38%[4];同時還含有豐富的維生素,屬于高營養(yǎng)、低脂肪、低能量的理想營養(yǎng)、健康天然食材[5]。滸苔蛋白質(zhì)水解可以產(chǎn)生含有數(shù)個到數(shù)十個氨基酸的肽類物質(zhì),肽類物質(zhì)不僅具有營養(yǎng)價值,更有利于人體消化吸收,并可能具有一定的生物學功能,在功能性食品中有重要的應(yīng)用價值[6]。近年來,因酶解法具有條件溫和、安全性高、易控制、成本低、蛋白質(zhì)肽鏈斷裂位點具有特異性等優(yōu)點,選擇適當?shù)牡鞍酌杆鈩又参锏鞍字苽浠钚噪某蔀檠芯繜狳c[7]。Wu等[8]利用蛋白酶水解鯖魚蛋白,獲得三種對清除DPPH自由基有明顯效果的多肽。目前國內(nèi)外研究人員對滸苔的研究多集中在多糖的提取、純化及抗氧化活性等方面,對滸苔蛋白水解物的抗氧化活性研究較少。

本文以產(chǎn)于浙江沿海的條滸苔為原料,以水解度及DPPH清除率為評價指標,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化中性蛋白酶制備條滸苔抗氧化肽工藝條件。采用膜分離技術(shù)將酶解物分離成不同相對分子質(zhì)量的三個組分,通過體外模擬消化試驗測定其消化穩(wěn)定性,為開發(fā)滸苔保健品,提高天然滸苔的利用價值,變“害”為“寶”提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

條滸苔 產(chǎn)于浙江舟山,用潔凈海水清洗干凈,30 ℃干燥備用;纖維素酶(5.0×104U/g)、中性蛋白酶(4.3×104U/g) 河南圣斯德實業(yè)有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 分析純,福州飛凈生物科技有限公司;其它試劑 均為國產(chǎn)分析純試劑。

ZNC-701超微粉碎機 北京華儀高科技電氣設(shè)備有限公司;CMD2000/4濕法超微粉碎機 切可(上海)機械設(shè)備有限公司;Seven Easy S20 pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SHA-2數(shù)顯冷凍水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市億通電子有限公司;SP-754紫外分光光度計 上海光譜儀器有限公司;DMJ60-3三級膜分離過濾系統(tǒng) 山東博納生物科技集團有限公司;AS-LGJ-10FG真空冷凍干燥機 鄭州宏郎儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 條滸苔→干法微粉碎→濕法超微粉碎→纖維素酶酶解→調(diào)pH→加中性蛋白酶酶解→滅酶→離心→取上清液→樣品

操作要點:干滸苔用超微粉碎機粉碎,過80目篩,按固液比1∶20 g/mL,加蒸餾水,于濕法超微粉碎機中回流粉碎40 min,頻率40 Hz,制得滸苔勻漿保存于4 ℃冰箱備用。纖維酶水解滸苔勻漿條件為pH3.0,加酶量5%(W/V),溫度25 ℃,振蕩酶解6.5 h,于98 ℃水浴鍋滅酶10 min,冷卻后以10000 r/min離心15 min,取上清備用。

1.2.2 單因素實驗設(shè)計 以水解度和DPPH自由基清除率為指標,考察酶解時間、pH、酶解溫度、加酶量、固液比5個因素對指標的影響[9]。

1.2.2.1 溫度的影響 在pH7,酶解時間3.5 h、加酶量1000 U/g pro、固液比1∶20 g/mL的條件下,溫度設(shè)為25、35、45、55、65 ℃。

1.2.2.2 pH的影響 在酶解時間3.5 h,加酶量1000 U/g pro,固液比1∶20 g/mL,酶解溫度45 ℃的條件下,pH設(shè)為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。

1.2.2.3 酶解時間的影響 在酶解溫度45 ℃,pH7,加酶量1000 U/g pro,固液比1∶20 g/mL的條件下,時間設(shè)為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h。

1.2.2.4 加酶量的影響 在酶解溫度45 ℃,pH7,酶解時間3.5 h,固液比1∶20 g/mL的條件下,加酶量為500、1000、2000、3000、4000、5000 U/g pro。

1.2.2.5 固液比的影響 在酶解溫度45 ℃、pH7、酶解時間3.5 h,加酶量1000 U/g pro的條件下,固液比設(shè)為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL,把不同固液比的水解物稀釋到相同濃度再離心,取上清液。

1.2.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計 選取單因素試驗中對指標水解度和DPPH自由基清除率有顯著影響的溫度、加酶量、pH和反應(yīng)時間四個因素作為考察對象,采用Design-Expert的中心組合試驗設(shè)計方法[10],設(shè)計了四因素三水平的實驗方案,因素與水平見表1。

10月14日，中國銀行昭通市分行副行長岳浩代表中國銀行向該行昭通市分行掛鉤扶貧點——彝良縣樹林鄉(xiāng)管壩村捐贈10萬元，用于援建該村紙廠村民活動廣場，助力該村基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface

1.2.4 指標的測定

1.2.4.1 水解度 采用甲醛滴定法[11-12]測定。取條滸苔水解液5 mL于燒杯中,加入25 mL去離子水,磁力攪拌并用精密pH計指示pH,先用0.1 mol/L標準NaOH滴定至pH=8.2時,加入中性甲醛溶液10 mL混勻,再用0.1 mol/L標準NaOH繼續(xù)滴定至pH=9.2,記錄將其pH滴定至9.2時所消耗的NaOH溶液的體積。同時取水30 mL,做試劑空白。

水解度(DH)測定的計算公式如下式(1):

式(1)

式中:X-水解后生成的氨基態(tài)氮的含量,g;N-樣品總氮含量,g。

其中總氮采用凱氏定氮法參照國標文獻GB 5009.5-2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》測定,X按式(2)計算:

式(2)

式中:V1-測定用樣品加入甲醛稀釋后消耗氫氧化鈉標準液的體積(mL);V2-試劑空白試驗加入甲醛后消耗氫氧化鈉標準的體積(mL);V3-樣品稀釋液取用量(mL);C-氫氧化鈉標準液的濃度(mol/L);14-氮的摩爾質(zhì)量(g/mol)。

1.2.4.2 DPPH自由基清除率測定 將2 mL樣品及2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液加入同一試管中,振蕩搖勻,室溫條件避光反應(yīng)30 min后在517 nm處測定吸光值A(chǔ)s。同時測定2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液與等體積乙醇混合液的吸光度Ac,以及2 mL樣品與等體積乙醇混合液的吸光度A0[13-14]。DPPH自由基清除率按式(3)計算[15]:

式(3)

式中:Ac為未加樣品時DPPH溶液的吸光度;As為加樣品時DPPH溶液的吸光度;Ao為未加DPPH樣品的吸光度。

1.2.5 不同肽段的制備 酶解物用截留分子質(zhì)量為3、10 kDa的三級膜分離過濾系統(tǒng)分為3個組分,凍干備用,分別命名為條滸苔肽Ⅰ(Mw≤3 kDa)、條滸苔肽Ⅱ(3 kDa10 kDa)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 溫度對水解度和DPPH清除率的影響 圖1顯示,溫度對條滸苔酶解物的水解度及DPPH清除率影響較大,在測定溫度范圍內(nèi),隨著溫度的上升,水解度和DPPH清除率呈先上升后下降的趨勢,在45 ℃時二者均達到最高值:水解度為11.74%±0.36%,DPPH清除率為78.7%±0.81%。當溫度高于45 ℃時,可能因為酶的活性受到了抑制,所以水解度和清除率急劇下降[18]。

圖1 溫度對水解度和DPPH清除率的影響Fig.1 Effect of temperature on degree of hydrolysis and DPPH clearance

2.1.2 pH對水解度和DPPH清除率的影響 酶促反應(yīng)中,酶活力受到pH影響較大。圖2表明,pH在6.0～7.5的范圍內(nèi),水解度和DPPH清除率隨著pH的增加而增大,至7.5時二者分別達最大值,水解度為10.83%±0.33%,DPPH清除率為73.83%±1.42%。隨著pH的進一步提高,水解度和DPPH清除率呈下降趨勢。

圖2 pH對水解度和DPPH清除率的影響Fig.2 Effect of pH on degree of hydrolysis and DPPH clearance

2.1.3 酶解時間對水解度和DPPH清除率的影響 由圖3可見,酶解初期,水解度隨著酶解時間的增加而增大,在酶解時間為3.5 h時趨于穩(wěn)定,而DPPH清除率先升高后降低,在酶解時間為3.5 h時達到最大值71.70%±0.72%。兩者的變化趨勢不一樣的可能原因是隨著酶解時間的增加,一些小分子的多肽水解為氨基酸,從而喪失了抗氧化活性,這結(jié)果與馮艷霞[19]等研究結(jié)果相似。

圖3 時間對水解度和DPPH清除率的影響Fig.3 Effect of time on degree of hydrolysis and DPPH clearance

2.1.4 加酶量對水解度和DPPH清除率的影響 圖4顯示,加酶量在500～3000 U/g pro范圍內(nèi),水解度隨著加酶量的增加呈上升趨勢,3000 U/g pro時達到最大值12.64%±0.23%。水解過程中,隨著添加量的增大,大分子蛋白在較短時間內(nèi)被降解,水解度迅速提高,當添加過大時底物已被酶所飽和,導致酶與酶之間產(chǎn)生競爭,反而導致水解能力下降,水解度明顯降低[20]。隨著加酶量的增加,DPPH自由基清除率呈先上升后下降的趨勢,當加酶量為3000 U/g pro時,DPPH自由基清除率達到最大值81.32%±1.56%,因此,中性蛋白酶水解條滸苔蛋白的適宜加酶量為3000 U/g pro。

圖4 加酶量對水解度和DPPH清除率的影響Fig.4 Effect of enzyme amount on degree of hydrolysis and DPPH clearance

2.1.5 固液比對水解度和DPPH清除率的影響 圖5顯示,隨著固液比的不斷增大,即條滸苔蛋白濃度的降低,水解度呈降低趨勢。說明在水解過程中,條滸苔蛋白濃度的降低,降低了水解的反應(yīng)速度,從而導致了水解度的降低。DPPH自由基清率隨著料液比的上升而下降,但幅度不大幾乎處于穩(wěn)定狀態(tài),表明固液比在中性蛋白酶水解中對酶解物的DPPH自由基清率影響較小[21]。在固液比為1∶20 g/mL時酶解液的水解度和DPPH自由基清除率達到最大值，水解度為9.03%±0.036%,DPPH清除率為44.42%±0.247%,故酶解條滸苔蛋白最適固液比為1∶20 g/mL。

圖5 固液比對水解度和DPPH清除率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on degree of hydrolysis and DPPH clearance

2.2 響應(yīng)面分析結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果 通過對單因素實驗結(jié)果的方差分析,篩選出對指標有顯著影響的因素,并確定其條件范圍,采用Design-Expert 8.0的Box-Behnken中心組合法設(shè)計響應(yīng)面實驗方案,共有27個試驗點,其中2、7、17、19、21號為零點,是區(qū)域的中心點,用來估計試驗誤差。DPPH清除率為響應(yīng)值,響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計和結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

2.2.2 回歸方程擬合和方差分析 利用Design-Expert 8.0軟件對所得實驗數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合,得到DPPH自由基清除率與各因素變量的二次回歸方程模型為:

表3 DPPH清除率試驗方差分析表Table 3 Table of variance analysis of DPPH clearance test

2.2.3 響應(yīng)面分析 圖6～圖8是根據(jù)回歸方程繪制出的各因素交互作用的響應(yīng)面,反映了各因素在制備的過程中對響應(yīng)值的影響,其投影為等高線圖。該組圖直觀反映了時間、溫度、pH、加酶量分別對酶解液水解度和DPPH清除率的影響,而等高線的形狀則表示了兩因素之間的影響強弱,圓表示兩因素交互作用弱,橢圓則較強[23]。

圖6 反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間對DPPH清除率的交互作用及等高線Fig.6 Interaction effect and contour between temperature and time on DPPH clearance

圖7 pH和加酶量對DPPH清除率的交互作用及等高線Fig.7 Interaction effect and contour between pH and enzyme amount on DPPH clearance

圖8 pH和反應(yīng)時間對DPPH清除率的交互作用及等高線Fig.8 Interaction effect and contour between pH and time on DPPH clearance

由圖6可得時間與溫度的曲面都較陡,對DPPH清除率影響顯著,再根據(jù)等高線圖可得等高線呈橢圓,說明加酶量和溫度兩者交互作用較強,影響極顯著。

由圖7可知,加酶量與pH的曲面都比較陡,對DPPH清除率影響都比較大,作用極顯著,再根據(jù)等高線圖可得等高線呈橢圓,說明加酶量和pH兩者交互作用較強,影響顯著。

由圖8可得,pH對DPPH清除率的影響極顯著,曲面較陡,而時間對DPPH清除率影響不大,曲面較緩和。再根據(jù)等高線圖可得等高線呈橢圓,說明pH和時間兩者交互作用較強,影響顯著。

2.2.4 工藝條件的優(yōu)化和驗證 運用軟件得到酶法制備滸苔抗氧化肽的最佳工藝為:酶解溫度為47.55 ℃、pH為7.405、加酶量為3250 U/g pro、酶解時間為3.295 h,在此條件下DPPH清除率為85.53%。實際操作中稍作調(diào)整:反應(yīng)溫度為47 ℃、pH為7.4、加酶量為3300 U/g pro、反應(yīng)時間為3.3 h、固液比為1∶20 g/mL,做三次平行試驗,DPPH清除率分別為82.32%、86.66%、84.03%,使用SPSS 16.0進行T檢驗,由表4可知P>0.05,表明實際值與預測值無顯著差異,模型可靠。

表4 滸苔抗氧化肽DPPH清除率檢驗Table 4 DPPH clearance of enteromorpha antioxidant peptide

2.3 體外消化穩(wěn)定性

圖9表明,Mw≤3 kDa和3 kDa10 kDa組分。多重比較分析表明,酶解物經(jīng)過消化酶消化后,Mw≤3 kDa和3 kDa10 kDa組分的抗氧化活性顯著下降,可能是因為Mw>10 kDa的組分受到消化酶的水解進一步降解為不具有活性的肽類,而分子質(zhì)量小于10 kDa的肽可能因為結(jié)構(gòu)不符合消化酶的特異要求從而未被消化酶水解,因而能保持原有的抗氧化活性,Chiang等[24]和Wu等[25]的研究也報道了相似的結(jié)果。

圖9 不同肽段在消化酶作用前后DPPH自由基清除率的比較Fig.9 Comparison of DPPH free radical scavenging rates of different peptides before and after the action of digestive enzymes注:標記相同字母表示無顯著性差異(P>0.05), 標記不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論

采用酶水解技術(shù)水解條滸苔蛋白制備抗氧化肽,通過單因素試驗及建立響應(yīng)面模型優(yōu)化得到條滸苔抗氧化肽的最佳酶解條件為:酶解溫度47 ℃、pH7.4、加酶量3300 U/g pro、反應(yīng)時間3.3 h、固液比1∶20 mg/mL,在此條件下,抗氧化肽的DPPH清除率為84.33%,具有較高的抗氧化活性。同時將酶解液分離成Mw≤3 kDa、3 kDa10 kDa三個不同相對分子質(zhì)量的組分,通過體外模擬試驗測得相對分子質(zhì)量小于10 kDa的兩個組分具有較強的抗氧化活性和消化穩(wěn)定性。以上研究結(jié)果為條滸苔抗氧化肽成為功能性食品的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ),也為本課題的后續(xù)深入研究提供了理論依據(jù)和參考依據(jù)。