響應面法優化筍頭多糖微波超聲波輔助提取工藝

陳燦輝,林 彤,江文韜,李舒婷,李正一,陳 雯,鄭亞鳳

(福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002)

竹筍(Bamboo shoot)是禾本科亞竹科植物的新生芽或嫩莖[1],作為傳統森林蔬菜[2],在我國有悠久的栽培歷史,分布極其廣泛[3]。竹筍富含蛋白質、維生素、酚類、多糖等營養成分[4],具有開胃健脾、通腸排便、增強機體免疫等功效,其活性成分具有降血壓、降血脂、預防糖尿病、提高免疫力等功效[5-7]。竹筍可食用部分僅占鮮筍的30%,其余70%為筍頭等下腳料常被作為廢棄物而丟棄。這些廢棄物堆積腐爛,不僅造成生態環境的污染,還導致大量資源的浪費[8]。竹筍多糖是竹筍中重要的活性成分之一,試驗證實其具有抗氧化、抗衰老、降血糖、促進腸道菌群健康等多種生理活性[9-11]。筍頭等廢棄物也被證實是提取竹筍多糖廉價的優質材料來源[12]。因此,從筍頭中提取多糖對促進筍資源的綜合開發,提升筍加工產業具有顯著意義。

目前,對于竹筍多糖提取工藝的研究主要有傳統水提法、微波輔助提取、超聲波輔助提取、酶解法、酸解法、堿解法等。Zhang等[10]采用傳統水提法提取竹筍多糖,最優條件為:提取時間180 min、提取溫度100 ℃、料液比1∶15 g/mL,在此條件下竹筍多糖得率為6.82%,該方法雖然操作簡單,成本低廉,但時間長,能耗大。陳曉燕等[13]采用酶解法提取竹筍多糖,結果表明每0.3 g竹筍樣品中添加木瓜蛋白酶7200 U、果膠酶1080 U、纖維素酶360 U,料液比1∶35 g/mL、酶解時間2.2 h、酶解溫度60 ℃條件下,竹筍多糖得率為16.10%,酶解法顯著提高了竹筍多糖得率,但操作復雜,成本較高。張帥[14]通過微波輔助提取筍殼多糖,結果表明在最優條件為料液比1∶45 g/mL、微波時間3 min、微波功率800 W,筍殼多糖得率為1.41%,微波輔助提取能大幅度縮短提取時間,但效率較低。鄭炯等[15]采用超聲波輔助提取竹筍多糖,在料液比1∶40 g/mL、提取溫度55 ℃、超聲波功率400 W、超聲時間29 min條件下,麻竹筍多糖得率為2.49%,超聲波提取能縮短提取時間,降低提取溫度,但超聲波輔助提取熱效應不強,提取過程很難達到足夠的提取溫度[16]。微波-超聲波聯合輔助傳統水提,將微波、超聲波和熱水浸提的優點進行結合,通過微波-超聲波聯合處理破碎竹筍細胞壁結構,使得竹筍多糖能更快析出,縮短提取時間,而后通過熱水浸提維持較高的提取溫度,提升提取效率。

因此,本研究以福建毛竹筍筍頭為材料,研究水浴時間、水浴溫度、料液比、微波-超聲波時間、微波功率和超聲波功率對筍頭多糖提取率的影響,通過Box-Behnken試驗設計及響應面分析法對筍頭多糖微波-超聲波聯合輔助傳統水提工藝進行優化,并測定了筍頭多糖的總糖、蛋白質、糖醛酸含量,以期提高筍頭多糖提取率,為竹筍產業的綜合利用和筍頭多糖的進一步開發提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

福建毛竹筍 市售;葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、苯酚、亞硫酸鈉、濃硫酸、結晶酚、石油醚、95%乙醇、無水乙醇、間羥基聯苯、四硼酸鈉、半乳糖醛酸、考馬斯亮藍G-250、90%乙醇、85%磷酸等 均為國產分析純試劑;試驗用水 雙蒸水。

DHG-9030型鼓風干燥器 北京Tayasaf公司;YR-750A型多功能粉碎機 永康市五瑞工貿有限公司;SHB-ⅢS型循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司;RE-52A型精密分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;X#300B型微波-超聲波組合合成/萃取儀 北京祥鵠科技發展有限公司;HH型數顯恒溫水浴鍋 上海江星儀器有限公司;UV-2550型紫外可見分光光度計 日本島津技術有限公司;RE-52A型旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;SHA-C型水浴恒溫搖床 常州國華電器有限公司;LG-1.0型真空冷凍干燥機 新陽速凍設備制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料處理 取毛竹筍筍頭部分,切分至邊長約2 cm的正方小塊,清洗,于55 ℃烘箱中烘干至恒重,粉碎并過80目篩子,按液料比3 mL/g置于石油醚中處理2 h,取濾渣,按液料比4 mL/g置于95%乙醇中處理3 h,取濾渣,55 ℃烘箱中烘干至恒重,得到筍頭粉末(備用)。

1.2.2 微波-超聲波聯合輔助傳統水提 準確稱取1.0000 g筍頭粉末,按一定料液比加入雙蒸水,于微波-超聲波組合萃取儀中微波-超聲波處理,并于恒溫水浴鍋中進一步熱水浴處理,取濾液(用于多糖含量測定),于55 ℃條件下濃縮至1/4原液體積,通過Sevege法脫蛋白至無蛋白層析出,然后4 ℃條件下透析48 h,隨后4 ℃條件下醇沉過夜,取沉淀至真空冷凍干燥機中冷凍干燥,得到筍頭多糖。

1.2.3 筍頭多糖測定 取步驟1.2.2中濾液,定容,并進行多糖含量測定。本試驗采用硫酸-苯酚法[17]測定樣品中總糖含量,采用DNS法[18]測定樣品中還原糖含量,樣品中多糖含量為總糖含量減去還原糖含量,即:多糖含量=總糖含量-還原糖含量[19]。

1.2.3.1 硫酸-苯酚法標準曲線的建立 以烘干至恒重的葡萄糖為標準品繪制標準曲線,得到回歸方程為Y=7.575X-0.0049,R2=0.9984。式中:Y為波長490 nm下的吸光度值,X為葡萄糖含量(mg)。

1.2.3.2 DNS法標準曲線的建立 以烘干至恒重的葡萄糖為標準品繪制標準曲線,得到回歸方程為Y=0.679X-0.0598,R2=0.9971。式中:Y為波長540 nm下的吸光度值,X為葡萄糖含量(mg)。

1.3.3.3 筍頭多糖得率的計算

式中:Z表示筍頭多糖得率,%;q表示總糖含量,mg;r表示還原糖含量,mg;m表示筍頭粉末干重,g。

1.2.4 單因素實驗 準確稱取筍頭粉末1.0000 g,參考本實驗先前研究成果[14],以料液比1∶30 g/mL、水浴溫度80 ℃、水浴時間2 h、微波功率300 W、超聲波功率600 W、微波-超聲波時間3 min為基礎固定值,分別研究不同料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)、不同水浴溫度(60、70、80、90、100 ℃)、不同水浴時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)、不同超聲波功率(400、500、600、700、800 W)、不同微波功率(100、200、300、400、500 W)、不同微波-超聲波時間(1、2、3、4、5 min)對筍頭多糖得率的影響。

1.2.5 響應面優化 以單因素實驗為基礎,根據Box-Behnken的中心組合試驗原理,選定水浴溫度(A)、微波-超聲波時間(B)、微波功率(C)、水浴時間(D),4個對筍頭多糖得率影響較為顯著的因素作為自變量,筍頭多糖的得率作為響應值(Y),采取4因素3水平的響應面分析法,最終確定提取筍頭多糖的最佳工藝參數。響應面分析因素及水平見表1。

表1 響應面分析因素及水平Table1 Analytical factors and levels for response surface

1.2.6 傳統水提法對比實驗 準確稱取1.0000 g筍頭粉末,按料液比1∶30 g/mL加入雙蒸水,于93 ℃恒溫水浴鍋中熱水浴處理2.0 h,取濾液(測量多糖含量,方法同1.2.3)。

1.2.7 筍頭多糖化學成分分析 筍頭多糖采用硫酸-苯酚法[17]測定樣品中總糖含量,采用考馬斯亮藍法[20]測定樣品中蛋白質含量,采用間羥基聯苯比色法[21]測定樣品中糖醛酸含量。

1.2.7.1 硫酸-苯酚法標準曲線的建立 如上1.2.3.1。

1.2.7.2 考馬斯亮藍法標準曲線的建立 以牛血清蛋白為標準品繪制標準曲線,得到回歸方程為Y=7.7279X+0.0421,R2=0.9982。式中:Y為波長595 nm下的吸光度值,X為牛血清蛋白濃度(mg/mL)。

1.2.7.3 間羥基聯苯比色法標準曲線的建立 以半乳糖醛酸為標準品繪制標準曲線,得到回歸方程為Y=0.0074X+0.0197,R2=0.9957。式中:Y為波長520 nm下的吸光度值,X為半乳糖醛酸濃度(μg/mL)。

1.3 統計分析

該試驗均設置平行試驗,重復3次,結果由平均值表示;采用DPS 7.05、Origin 8.5、Design-Expert 8.0等軟件進行數據處理和統計分析。

2 結果與分析

2.1 微波-超聲波聯合輔助傳統水提筍頭多糖試驗結果

2.1.1 單因素實驗結果

2.1.1.1 料液比對筍頭多糖得率的影響 由圖1可得,隨著料液比的增加,筍頭多糖的得率逐漸增加,于1∶30 g/mL時達到最大值8.56%,之后逐漸下降,這可能是由于溶劑的快速增加,使得筍頭細胞內物質溶出速率和溶出物質快速提高,從而迅速改變筍頭細胞內外滲透壓的大小,抑制了筍頭多糖的溶出[14]。此外,過多的溶劑也會增加后期處理的工作量,效率降低。因此,最適的料液比為1∶30 g/mL。

圖1 不同料液比對多糖得率的影響Fig.1 Effect of different solid-to-liquid ratio on the polysaccharide yield注:圖中不同小寫英文字母代表差異顯著(P<0.05),圖2～圖6同。

2.1.1.2 水浴溫度對筍頭多糖得率的影響 由圖2可得,水浴溫度對筍頭多糖得率的影響顯著。在60～90 ℃時多糖得率隨著溫度的上升而增加,在90 ℃時達到最大值9.11%,隨后逐漸下降趨于平緩,這可能是由于筍頭多糖對高溫環境較為敏感,長時間的高溫環境可能使竹筍多糖的結構遭到破壞或降解,導致筍頭多糖得率下降[22]。因此,最適的水浴溫度為90 ℃。

圖2 不同水浴溫度對多糖得率的影響Fig.2 Effect of different water bath temperature on the polysaccharide yield

2.1.1.3 水浴時間對筍頭多糖得率的影響 由圖3可得,水浴時間對筍頭多糖得率影響較大。隨著水浴時間的延長,筍頭多糖得率呈現先增加后減少的趨勢,于2.0 h時達到最大值7.87%。這表明,一定的水浴時長有助于多糖析出,但過長的水浴時間也會導致部分多糖水解[23],得率下降。因此,最適的水浴時間為2.0 h。

圖3 不同水浴時間對多糖得率的影響Fig.3 Effect of different water bath time on the polysaccharide yield

2.1.1.4 超聲波功率對筍頭多糖得率的影響 由圖4可得,隨著超聲波功率的增加,筍頭多糖得率呈現先增加后減少的趨勢,于600 W時,達到最大值8.17%。超聲波功率較低時,超聲波對植物細胞壁具有破壁作用,筍頭中的多糖能快速的析出,隨著超聲波功率的增加,空化作用會降低,氣泡塌縮程度下降[24],且熱效應和破壁效應使得筍頭中的雜質析出也相應增加,筍頭多糖和雜質可能發生反應,使得多糖得率下降。而且超聲波作用的時間較短,相比其他因素,超聲波功率對多糖得率影響較小。

圖4 不同超聲波功率對多糖得率的影響Fig.4 Effect of different ultrasonic power on the polysaccharide yield

2.1.1.5 微波功率對筍頭多糖得率的影響 由圖5可得,隨著微波功率的增加,筍頭多糖得率逐漸上升,于300 W時,達到最大值8.80%,之后逐漸下降。這可能是由于微波功率增大,植物細胞內部能量增加,分子運動劇烈,短時間內多糖快速穿透細胞膜,得率提高。此外,過高的微波功率,可在短時間內產生較大的熱效應,加速浸提溫度的上升和浸提液的流動,使得筍頭多糖析出加快的同時多糖水解也加快,導致多糖得率下降[25]。因此,最適的微波功率為300 W。

圖5 不同微波功率對多糖得率的影響Fig.5 Effect of different microwave power on the polysaccharide yield

2.1.1.6 微波-超聲波時間對筍頭多糖得率的影響 由圖6可得,微波-超聲波時間對于筍頭多糖的得率影響較大。在1～3 min時,多糖得率從6.87%增加到7.74%,微波-超聲波時間超過3 min后,多糖得率開始下降。這可能是由于短時間的微波-超聲波可使植物細胞迅速破裂,細胞內的物質能快速的釋放到溶劑中,多糖得率上升,隨著微波-超聲波時間繼續的延長,析出的多糖被降解,導致得率下降[26-27]。因此,最適的微波-超聲波時間為3 min。

圖6 不同微波-超聲波時間對多糖得率的影響Fig.6 Effect of different microwave-ultrasonic wave time on the polysaccharide yield

2.1.2 響應面優化結果 在單因素實驗結果的基礎上,選定水浴溫度(A)、微波-超聲波時間(B)、微波功率(C)、水浴時間(D)4個對于筍頭多糖得率影響較為顯著的因素為自變量,筍頭多糖的得率為響應值(Y),結合Design expert 8.0.6軟件進行響應面分析,Box-behenken試驗設計及筍頭多糖得率的實測值見表2。軟件擬合出的二元多項式回歸模型方程為:Y=9.91+0.71A-0.060B+0.044C+0.046D+0.080AB-0.078AC-0.058AD+0.020BC+0.035BD+0.020CD-0.70A2-0.15B2-0.27C2-0.24D2。

表2 Box-Behnken試驗設計及筍頭多糖得率實測值Table 2 Box-behnken design and actual values of basal part of bamboo shoot polysaccharide yield

表3 回歸模型的方差分析Table 3 The result of variance analysis of regression model

P值可用來檢驗回歸模型各系數的顯著性,同時可以代表變量間相互作用的大小,即P值越小,越顯著[29]。由表3模型方差分析結果可知,水浴溫度和微波-超聲波時間兩交互作用(BC)P值為0.0016,對筍頭多糖得率影響極顯著(P<0.01);微波功率和水浴時間兩交互作用(CD)P值為0.0016,對筍頭多糖得率影響極顯著(P<0.01);其余項P值皆為<0.0001,對筍頭多糖得率影響顯示極顯著(P<0.01)。從F值大小可知,各因素對筍頭多糖得率的影響從大到小依序為:水浴溫度(A)>微波-超聲波時間(B)>水浴時間(D)>微波功率(C)。

2.1.3 響應面優化分析 采用Design Expert 8.0.6軟件對表2中的數據進行二次多元回歸擬合,二次回歸方程的響應面結果如圖7所示。由圖7可知,AB、AC、AD、BC、BD和CD響應面曲面坡度陡峭程度明顯,但相比BC、BD和CD,AB、AC和AD的曲面陡峭程度更加顯著,表明水浴溫度、微波-超聲波時間、水浴時間和微波功率,4個因素對筍頭多糖提取得率具有顯著影響,且水浴溫度的影響最顯著。

圖7 交互作用對筍頭多糖得率影響的響應面圖Fig.7 Response surface diagram of the effect of interactions on basal part of bamboo shoot polysaccharide yield

2.1.4 響應面優化結果及驗證 通過對回歸模型進行響應面分析,以筍頭多糖得率的最大化為目標,得到微波-超聲波聯合輔助傳統水提的最佳提取條件為:水浴溫度95.03 ℃、水浴時間2.02 h、料液比1∶30 g/mL、微波功率300.95 W、超聲波功率600 W、微波-超聲波時間2.94 min,在此提取條件下,回歸方程模型對筍頭多糖得率的預測值為10.09%。考慮實際操作條件的可行性,將提取條件參數修正為:水浴溫度95 ℃、水浴時間2.0 h、料液比1∶30 g/mL、微波功率300 W、超聲波功率600 W、微波-超聲波時間3.0 min,通過3次平行試驗測得筍頭多糖的實際得率為10.05%,與預測值接近,表明該回歸方程模型能較好的模擬和預測筍頭多糖的得率,較為真實的反映出各影響因素對筍頭多糖得率的影響。

2.2 傳統水提法對比試驗

在料液比1∶30 g/mL、提取時間2.0 h、提取溫度93 ℃的最優工藝參數條件下,傳統水提法的筍頭多糖得率為7.61%。通過結合微波-超聲波聯合輔助水提,筍頭多糖的得率為10.05%,提高32.06%,這可能是由于微波和超聲波的作用,加速了竹筍細胞壁的破碎,使得更多的多糖物質從細胞內析出,得率提高。

2.3 筍頭多糖化學成分分析

通過硫酸-苯酚法測得筍頭多糖的總糖含量為74.87%;通過考馬斯亮藍法測得筍頭多糖蛋白質含量為4.05%,由于先前通過Sevege法已脫除筍頭多糖溶液中游離的蛋白質,表明蛋白為結合蛋白,該多糖為雜多糖[11];通過間羥基聯苯法測得筍頭多糖的糖醛酸含量為1.89%,表明該多糖為酸性多糖[30-31]。

3 結論

筍頭多糖的微波-超聲波聯合輔助傳統水提最佳工藝參數為水浴溫度95 ℃、水浴時間2.0 h、料液比1∶30 g/mL、微波功率300 W、超聲波功率600 W、微波-超聲波時間3.0 min,在此條件下,筍頭多糖的得率為10.05%,所提多糖為酸性雜多糖,總糖、蛋白質和糖醛酸含量分別為74.87%、4.05%和1.89%。相比傳統水提法,微波-超聲波聯合輔助水提法使竹筍多糖得率提高32.06%,該方法具有能耗小、耗時短、效率高、無污染的優點。