環介導等溫擴增結合免疫層析試紙條快速檢測羊肉及其制品中的鴨源成分

柳海賓,張海鑫,宋騰飛,劉 聰,聶付磊

(華北理工大學生命科學學院,河北唐山 063200)

近年來,肉類及其制品的摻假現象屢見不鮮。肉類制品的摻假通常包括以價格或營養價值較低廉的肉代替價格較高的肉,以期降低商品的成本來獲得較高經濟利益[1-2]。這種行為損害消費者經濟利益、導致因過敏反應[3]帶來的健康風險,甚至影響肉類食品產業的健康發展。2014年在北京的一項調查顯示,羊肉及其制品中的摻假率高達40.8%,摻假物主要以鴨肉為主,還包括豬肉和雞肉等價格相對較低廉的肉類[4-5]。因此,為了保護消費者和生產者免受欺詐,確保食品安全和公眾健康,急需開發靈敏、快速、操作簡單、價格低廉的分析方法來確定肉類及其制品摻假的動物來源。

目前,對于肉類真偽鑒別的檢測方法主要是在蛋白質和核酸的水平進行,常用的檢測技術包括ELISA法[6]、質譜分析[7]、紅外光譜分析[8-9]、PCR為基礎的方法[10-11]和恒溫核酸擴增等基礎的方法[12-13]。環介導等溫擴增技術是一種恒溫核酸擴增方法,即可以在恒定溫度(60～65 ℃)下將幾個拷貝的核酸分子擴增109～1010倍[14]。由于環介導等溫擴增技術可以在恒定溫度下完成擴增反應,因此僅需要一臺數字化水浴鍋即可完成擴增過程,對儀器的依賴程度低。傳統的檢測環介導等溫擴增產物的方法主要是瓊脂糖凝膠電泳分析法[15]和熒光染料法[16]。電泳分析法需要電泳儀、專業的操作人員而且耗時相對較長(30 min)。熒光染料法是利用染料與雙鏈DNA結合并產生熒光實現對LAMP產物的檢測,該法雖然簡化了檢測步驟,但熒光染料的加入可能會對LAMP反應產生抑制作用[17]。免疫層析試紙條法可以在無需儀器的情況下實現對LAMP產物的可視化快速檢測,完成整個檢測過程只需5 min,通過肉眼即可觀察檢測結果[18],是一種快速、特異性強、靈敏度高的檢測方法。

本研究將LAMP技術與免疫層析試紙條相結合,根據鴨線粒體基因設計LAMP引物,通過試驗條件的優化,建立了一種可在羊肉及其制品中特異性檢測鴨源成分的快速檢測方法。本方法的建立為羊肉及其制品的摻假鑒別提供方法依據,為監管部門提供可靠的執法依據,具有廣闊的應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮的羊肉、豬肉、鴨肉、雞肉、兔肉、驢肉、馬肉、鵝肉、狗肉、鴿子肉,羊肉片、醬羊肉、羊肉串、鴨肉、熟鴨肉等商業化產品20份 唐山市各屠宰場及大型超市;WarmStart?LAMP試劑盒 New England biolabs公司;硝酸纖維素膜、PVC背板、吸水紙、玻璃纖維 上海金標生物科技有限公司;氯金酸、檸檬酸三鈉、鏈霉親和素 Sigma公司;天根基因組DNA提取試劑盒 天根生物科技有限公司;鼠抗地高辛單克隆抗體 Abcam公司。

Gel Doc 2000凝膠成像系統 美國Bio-Rad公司;SY-1-2電熱恒溫水浴鍋 天津歐諾儀器儀表有限公司;HM3035雙維往復劃膜儀、ZQ2000微電腦自動斬切機 上海金標生物科技有限司;6132紫外可見分光光度計 德國Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的收集和處理 新鮮的羊肉、豬肉、鴨肉、雞肉、兔肉、驢肉、馬肉、鵝肉、狗肉、鴿子肉購自唐山市各大型超市及屠宰場;同時采集羊肉片、醬羊肉、羊肉串、鴨肉、熟鴨肉等商業化產品20份,將所有采集回來的樣品使用蒸餾水沖洗干凈切碎于-20 ℃保存備用。為了模擬不同程度的摻假肉樣品,將切碎的羊肉和鴨肉按不同質量比例混合均勻制備標準樣品,鴨肉與羊肉混合的比例分別為100%、0%、25%、10%、5%、1%、0.1%、0.01%、0.001%、0%,將模擬的標準肉樣品充分混合均勻后于-20 ℃保存備用。

1.2.2 DNA的提取 采用天根基因組DNA提取試劑盒提取肉樣品基因組DNA,使用紫外可見分光光度計測定提取的DNA樣品的OD260/OD280值,測定值需在1.7～1.9之間才能保證提取的DNA有較高的純度[19]。

1.2.3 LAMP引物的設計 根據GenBank數據庫中鴨線粒體基因序列(EU009397.1),采用在線LAMP引物設計軟件primer explorer V4設計鴨特異性LAMP引物,引物序列如表1所示,F3、B3為兩條外引物,FIP、BIP為內引物,LF、LB為環引物,引物設計好后由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 LAMP引物序列Table 1 Primer sequences of LAMP

1.2.4 膠體金免疫層析試紙條的制備 根據Grabar等[20]報道的方法,合成粒徑(15±3) nm的膠體金。地高辛抗體偶聯膠體金納米粒子的制備及試紙條的組裝依據之前優化的結果[21]。試紙條的組成部分包括吸水紙、硝酸纖維素膜、金標墊、樣品墊、PVC背板;各部分按圖1所示的順序進行組裝,即硝酸纖維素膜貼在PVC背板的中間,兩側分別粘貼樣品墊和吸水紙,在硝酸纖維素膜和樣品墊之間粘貼金標墊。最后使用微電腦自動斬切機將組裝好的試紙條切割成3.7 mm寬的條,室溫干燥下避光保存、備用。試紙條的工作原理主要是免疫夾心反應(圖1)。LAMP擴增反應結束后會產生大量生物素和地高辛標記的雙鏈DNA產物,將LAMP擴增產物與上樣緩沖液混合后滴加于試紙條的樣品墊上,混合液首先與金標墊上的鼠抗地高辛抗體包裹的膠體金納米粒子特異性結合,形成生物素-DNA-地高辛-鼠抗地高辛抗體-金納米粒子復合物,該復合物在毛細管的作用下向吸水紙方向移動,與檢測線上的鏈霉親和素發生特異性結合反應,膠體金納米粒子在檢測線上的富集形成肉眼可見的紅色條帶,過量的鼠抗地高辛抗體偶聯的金納米粒子繼續向吸水紙方向移動,與質控線上的羊抗鼠二抗發生特異性結合反應,使質控線上形成肉眼可見的紅色條帶。因此,在目標物存在的情況下,即有生物素和地高辛標記的雙鏈DNA產物時,試紙條上形成兩條肉眼可見的紅色條帶;在目標物不存在的情況下,不會產生生物素和地高辛標記的雙鏈DNA產物,試紙條檢測線不會顯色,僅質控線顯色。質控線存在的目的是為了驗證試紙條是否能正常工作。

圖1 LAMP-ICTS檢測原理Fig.1 Schematic diagram of LAMP-ICTS

1.2.5 LAMP擴增反應 根據LAMP試劑盒的操作說明進行擴增反應。首先需要配制10×引物儲備液,儲備液中各引物的濃度分別為:FIP:16 μmol/L,BIP:16 μmol/L,F3:2 μmol/L,B3:2 μmol/L,LF:4 μmol/L,LB:4 μmol/L。LAMP擴增反應體系為:2×master mix:12.5 μL,引物mix:2.5 μL,DNA模板:1 μL,蒸餾水:9 μL。配制好LAMP反應體系后上下顛倒混勻并簡短離心以除去管內壁上的液珠,分別在61、63、65、67、69 ℃的溫度下反應30 min來優化LAMP反應溫度,隨后80 ℃下處理5 min來結束擴增反應,反應產物使用試紙條進行檢測。

1.2.6 對試紙條的工作條件進行優化 在實際應用試紙條進行檢測的過程中發現,NC膜的流速和上樣緩沖液的種類對試紙條檢測的靈敏度影響較大,因此對不同流速的NC膜(180、135、90 s/4 cm)和不同種類的上樣緩沖液(pH=7.4的0.01 mol/L的PB緩沖液,pH分別為5.6,7.4,8.5的0.01 mol/L的PBS緩沖液)進行測試。測試方法為:對NC膜進行優化時,取10 μL的LAMP產物與90 μL的0.01 mol/L的PBS pH=7.4混合均勻后,滴加于不同種類NC膜組成的試紙條的樣品墊上,5 min后觀察檢測結果;對上樣緩沖液進行優化時,取10 μL的LAMP產物與90 μL的不同種類的上樣緩沖液,混合均勻后,滴加于試紙條的樣品墊上,此時NC膜使用HF135s,5 min后觀察檢測試紙條顯色情況。

1.2.7 LAMP-ICTS靈敏度及特異性分析 將步驟1.2.1制備的不同鴨肉摻入比例的肉樣品提取基因組DNA后,使用LAMP擴增技術進行擴增,并同時使用瓊脂糖凝膠電泳[22]和試紙條進行檢測,對試紙條和瓊脂糖凝膠電泳的靈敏度進行比較分析。陰性對照組采用同等體積的蒸餾水代替基因組DNA進行LAMP擴增反應,反應后同樣使用試紙條進行檢測。分別以魚肉、雞肉等10種肉樣品的基因組DNA為模板進行LAMP擴增,使用試紙條進行檢測,檢驗LAMP-ICTS方法的特異性。

1.2.8 LAMP-ICTS檢測實際樣品 從唐山市各大型超市、農貿市場、飯店和淘寶網購買經加工和未經加工的肉制品20份,分別提取其基因組DNA后,進行LAMP擴增反應,并使用試紙條進行檢測,同時使用行業標準中鴨成分檢測PCR法[23]對LAMP-ICTS的檢測結果進行驗證,以確定LAMP-ICTS方法的準確性。

2 結果與分析

2.1 LAMP擴增反應溫度的優化

將配制好的LAMP體系分別放置在61、63、65、67、69 ℃的溫度下反應30 min,使用試紙條對擴增產物進行檢測,結果如圖2所示。擴增反應溫度為65 ℃時,試紙條的紅色條帶最明顯,因此LAMP擴增反應最優的溫度為65 ℃。

圖2 LAMP擴增反應溫度優化Fig.2 Optimization the amplification temperature of LAMP注:C:質控線;T:檢測線;圖3～圖5同。

2.2 試紙條工作條件的優化

對試紙條NC膜的流速和上樣緩沖液的種類優化的結果如圖3所示,上樣緩沖液對鏈霉親和素和生物素結合影響較大,即主要影響檢測線的顯色情況。當上樣緩沖液為PBS(pH=7.4),NC膜型號為HF135 s時,試紙條顯色較好。

圖3 優化上樣緩沖液(A)和NC膜孔徑(B)Fig.3 Optimization of running buffer(A) and the flow rate of NC membrane(B)注:RB1:PBS(pH=7.4);RB2:PB(pH=7.4);RB3:PBS(pH=5.6);RB4:PBS(pH=8.5)。

2.3 LAMP-ICTS檢測鴨源成分的靈敏度

在最優的LAMP擴增反應溫度及最優的試紙條工作條件下,LAMP-ICTS的檢測靈敏度如圖4A所示,LAMP-ICTS可檢測到0.01%的鴨源性成分,隨著鴨源性成分含量的增加,試紙條檢測線顏色的深度呈增加的趨勢。使用瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel eletrophoresis,AGE)對LAMP擴增產物進行檢測,檢測結果如圖4B所示,LAMP-AGE可檢測0.1%的鴨源性成分。LAMP-ICTS與LAMP-AGE相比,檢測的靈敏度提高了10倍。Zhao等[11]建立的PCR-ICTS方法檢測火雞成分,最低檢測限為0.1%,檢測靈敏度較低且需要PCR儀。李向麗等[24]建立LAMP-SYBRGreen I方法檢測羊肉中的豬源、鴨源和羊源性成分,檢測限為0.5%。

圖4 LAMP-ICTS(A)和LAMP-AGE(B)檢測鴨源性成分的靈敏度Fig.4 Sensitivity of LAMP-ICTS(A)and LAMP-AGE(B) in detection of duck derived components注:NC:陰性對照;M:DNA marker。

Karabasanavar等[25]建立的PCR-電泳方法檢測豬源性成分,其檢測限為0.1%。Vaagt等[26]建立的LAMP-電泳方法檢測毒蘑菇,其檢測限為0.2%。因此,與文獻[11,24-26]中建立的方法相比,本研究建立的LAMP-ICTS方法靈敏度高、對儀器的依賴程度低,更適用于基層單位和政府部門對肉類產品進行現場檢測。

2.4 LAMP-ICTS特異性分析

LAMP-ICTS特異性驗證結果如圖5所示,只有在LAMP擴增反應過程中加入鴨肉中提取的模板DNA后,試紙條有兩條紅色條帶,其他的動物源性DNA只能使試紙條質控線顯色,因此本研究建立的LAMP-ICTS對肉樣品中鴨源性成分有很好的特異性。

圖5 LAMP-ICTS的特異性Fig.5 Specificity of LAMP-ICTS注:1:鴨;2:羊;3:豬;4:雞;5:兔;6:驢;7:馬;8:鵝;9:狗;10:鴿子。

2.5 LAMP-ICTS檢測實際樣品

鴨源性成分為羊肉及其制品中較常見的摻假成分[4],采用本研究建立的LAMP-ICTS方法對超市和農貿市場等地采集的20份肉樣品進行鴨源性成分檢測,并與行業標準方法相比較,兩種方法的檢測結果如表2所示。所采集的5份羊肉片樣品(樣品編號:1～5)中有2份檢測出鴨肉成分;所采集的5份熟制羊肉制品(樣品編號:6～10)中未檢測到鴨肉成分;所采集的5份羊肉串(樣品編號:11～15)中有3份檢測出鴨肉成分。新鮮的鴨肉及熟制的鴨肉中均檢測出鴨源性成分。本研究采集的少量羊肉樣品中有鴨源性成分檢出,表明市售的羊肉制品中確實存在摻假現象。此外,LAMP-ICTS檢測結果與行業標準方法的檢測結果一致,因此本研究建立的方法具有很好的準確性。

表2 實際食品樣品檢測結果Table 2 Testing results of real food sample

3 結論

羊肉及其制品因其獨特的風味和營養價值備受消費者青睞。但不法商販為牟取更高的利益,常常用價值較低的鴨肉代替羊肉,這種行為嚴重損害消費者的經濟利益。本研究通過恒溫擴增結合試紙條檢測,建立了LAMP-ICTS法檢測羊肉及其制品中的鴨源性成分的新方法。本方法可以快速準確的檢測羊肉及其制品中0.01%的鴨源性成分,完成整個檢測過程僅需40 min。利用20種市售羊肉、鴨肉樣品評價LAMP-ICTS方法的準確性,結果顯示LAMP-ICTS方法與行業標準方法(PCR-電泳)的檢測結果一致。本研究建立的方法操作簡單、對儀器的依賴程度低(僅需要一臺數字化恒溫水浴鍋),可作為肉及其制品中摻假成分鑒別檢測的有效工具。通過改變LAMP引物,可將LAMP-ICTS方法應用于其他摻假肉類品種的檢測,即LAMP-ICTS方法在食品安全檢測領域會有更大的應用前景。