花旗參茶對(duì)乙醇誘導(dǎo)小鼠氧化損傷的保護(hù)作用

陳斯琪,李雅琦,余孝云,尚 強(qiáng),3,伍 彪,聶 克,*

(1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院,廣東廣州 510006;2.健康藥業(yè)(中國(guó))有限公司,廣東珠海 519090;3.國(guó)家中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心,廣東珠海 519090)

西洋參為五加科植物西洋參(PanaxquinquefoliumL.)的干燥根,又名花旗參,具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津等功效[1]。現(xiàn)代研究表明,西洋參具有抗氧化[2]、調(diào)節(jié)免疫[3]、抗腫瘤[4]、保護(hù)心血管系統(tǒng)[5]、抗衰老[6]、抗炎[7]、改善糖脂代謝[8]和改善腸道菌群[9]等生物活性,可通過(guò)恢復(fù)體內(nèi)平衡預(yù)防和治療多種疾病[10]。民間有用西洋參飲片泡水服用、煲湯等習(xí)慣。花旗參茶是用西洋參經(jīng)現(xiàn)代工藝制成的顆粒劑,用開(kāi)水沖調(diào)即可飲用,具有便于攜帶、便于服用等優(yōu)點(diǎn)。但是目前對(duì)花旗參茶的營(yíng)養(yǎng)和保健作用的機(jī)制研究較少。

大量攝入乙醇可產(chǎn)生過(guò)量氧自由基,引起組織細(xì)胞過(guò)氧化以及肝臟脂肪變性、肝細(xì)胞壞死等病變[11]。機(jī)體氧化損傷是導(dǎo)致酒精性肝病的重要原因之一,其機(jī)制主要與機(jī)體氧化還原失衡、脂質(zhì)過(guò)氧化等有關(guān)[12-13]。已有研究報(bào)道,乙醇能導(dǎo)致動(dòng)物氧化應(yīng)激,損傷肝臟,使體內(nèi)的丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、蛋白質(zhì)羰基(Protein carbonyl,PC)水平顯著升高,總超氧化物歧化酶(Total superoxide dismutase,T-SOD)、微量還原型谷胱甘肽(Reduced glutathione,GSH)水平顯著降低,丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(Aminotransferase,AST)、甘油三酯(Triglyceride,TG)水平顯著升高[14-16]。

本文根據(jù)原國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局保健食品《抗氧化功能評(píng)價(jià)方法(征求意見(jiàn)稿)》[17],采用乙醇氧化損傷小鼠模型,觀察了花旗參茶的抗氧化損傷作用以及對(duì)乙醇所致肝損傷的保護(hù)作用,并與西洋參飲片泡水服用的抗氧化效果進(jìn)行了對(duì)比。本研究首次從抗氧化和保護(hù)肝臟等方面對(duì)花旗參茶的保健作用機(jī)制進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究,為其保健應(yīng)用提供了一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花旗參茶 3 g/袋,健康藥業(yè)(中國(guó))有限公司;MDA試劑盒、PC試劑盒、T-SOD試劑盒、GSH試劑盒、總蛋白(Total protein,TP)試劑盒、ALT試劑盒、AST試劑盒、TG試劑盒 南京建成生物工程研究所;其他試劑 均為分析純;SPF級(jí)健康成年昆明小鼠 60只,雌性,體質(zhì)量17.01±0.16 g,由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào)SCXK(粵)2016-0041,飼養(yǎng)于溫度為20～25 ℃,濕度為40%～70%,12 h光照,12 h黑暗的環(huán)境,自由攝食和飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。

UV-2310 Ⅱ型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司;BioTek Eon型超微量核酸蛋白分析儀 廣州云星科學(xué)儀器有限公司;TGL-16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;NIKON Eclipse ci光學(xué)顯微鏡 日本尼康株式會(huì)社。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 西洋參飲片泡水樣品制備 取西洋參飲片200 g,加16倍沸水,浸泡5 min,重復(fù)3次,合并濾液,濾過(guò),濃縮,冷凍干燥,得凍干粉40 g。

1.2.2 動(dòng)物分組與給藥 選取25～30 g小鼠,隨機(jī)分為6組:空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、花旗參茶(參茶組)低中高3個(gè)劑量組、西洋參飲片泡水(飲片泡水)對(duì)照組,每組10只。參茶3個(gè)劑量組分別灌胃給予參茶1.5、3.0、6.0 g/kg(參茶成人每日推薦用量為9 g,成人體重按60 kg計(jì),則人用量為0.15 g/kg體重。根據(jù)藥效學(xué)研究中人與小鼠給藥劑量的換算方法[18],小鼠劑量分別相當(dāng)于人用量的10倍、20倍、40倍,每3 g參茶顆粒相當(dāng)于原生藥0.55 g,則分別相當(dāng)于0.275、0.550、1.100 g生藥/kg體重),飲片泡水組給予泡水凍干粉0.1 g/kg(西洋參飲片成人每日用量為3 g,成人體重按60 kg計(jì),則人用量為0.5 g/kg體重。小鼠給藥劑量相當(dāng)于人用量的10倍,1 g凍干粉相當(dāng)于原生藥5 g,則相當(dāng)于0.500 g生藥/kg體重),模型對(duì)照組和空白對(duì)照組給予蒸餾水,各組動(dòng)物灌胃容積均為20 mL/kg,連續(xù)30 d,根據(jù)每周體重調(diào)整給藥劑量。

1.2.3 指標(biāo)檢測(cè) 每周稱(chēng)量并記錄小鼠體重,共4周。末次灌胃后,模型對(duì)照組和各給藥組禁食16 h(過(guò)夜),稱(chēng)量小鼠體重,一次性灌胃給予50%乙醇12 mL/kg bw造模,6 h后摘眼球取血(空白對(duì)照組不作處理,不禁食取血),4 ℃、2000 r/min離心10 min,制備血清,-80 ℃冰箱保存待測(cè)。取血后脫頸椎處死小鼠,解剖,迅速取出肝臟,一部分肝組織放入4%多聚甲醛固定,常規(guī)石蠟切片、HE染色;另一部分肝組織用生理鹽水或試劑盒勻漿介質(zhì)低溫勻漿,4 ℃ 2000 r/min離心10 min,取上清液,待測(cè)。取出脾臟和胸腺,稱(chēng)重,按以下公式計(jì)算脾臟系數(shù)和胸腺系數(shù):脾臟系數(shù)(mg/g)=脾臟重量(mg)/體重(g),胸腺系數(shù)(mg/g)=胸腺重量(mg)/體重(g)。

按照試劑盒說(shuō)明書(shū),分別檢測(cè)血清和肝勻漿MDA、PC、T-SOD和GSH水平;檢測(cè)血清ALT、AST和TG水平。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 花旗參茶對(duì)小鼠體重的影響

由表1可知,實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠體重隨時(shí)間延長(zhǎng)而增長(zhǎng),在不同時(shí)間點(diǎn)各組小組體重分別兩兩比較,均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。說(shuō)明花旗參茶和西洋參飲片泡水對(duì)正常小鼠體重增長(zhǎng)無(wú)明顯影響。

表1 各組小鼠體重變化(g)Table 1 Body weight of mice in each group(g)

2.2 花旗參茶對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

由表2可知,各組小鼠胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)分別兩兩比較,均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。說(shuō)明花旗參茶和西洋參飲片泡水在實(shí)驗(yàn)劑量范圍對(duì)小鼠的胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)無(wú)明顯影響。

表2 各組小鼠臟器系數(shù)變化(mg/g)Table 2 Organ coefficient of mice in each group(mg/g)

2.3 花旗參茶對(duì)小鼠體內(nèi)氧化損傷相關(guān)指標(biāo)MDA、PC、T-SOD和GSH含量的影響

MDA是一種脂質(zhì)氧化產(chǎn)物,其含量高低可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度,間接地反映出細(xì)胞損傷的程度[19],PC可與生物大分子相互作用,引起羰基應(yīng)激和氧化應(yīng)激[20];T-SOD作為抗氧化系統(tǒng)的第一道防線(xiàn),可清除超氧陰離子自由基,保護(hù)細(xì)胞免受損傷,對(duì)機(jī)體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用[21];氧化損傷的細(xì)胞中還原型和氧化型谷胱甘肽比例失衡,GSH作為一種低分子清除劑,可清除O2-、H2O2等,GSH含量是衡量機(jī)體抗氧化能力大小的重要因素[22]。

由表3可知,與空白對(duì)照組比較,模型組小鼠血清和肝組織中MDA和PC水平極顯著升高(P<0.01),T-SOD和GSH水平顯著降低(P<0.01),說(shuō)明50%乙醇氧化損傷模型成功。與模型組比較,參茶低、中、高3個(gè)劑量組血清中MDA和PC水平均極顯著降低(P<0.01),GSH水平極顯著升高(低、中、高3個(gè)劑量,均P<0.01),T-SOD水平顯著升高(低、中劑量,P<0.05;高劑量,P<0.01);飲片泡水組血清中MDA和PC水平極顯著降低(P<0.01),GSH水平顯著升高(P<0.05),T-SOD水平有升高趨勢(shì)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。與空白對(duì)照組比較,參茶低、中、高3個(gè)劑量組血清中的MDA和PC水平升高,T-SOD水平降低,低、中劑量組的GSH水平降低,高劑量組的GSH水平升高,但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);飲片泡水組血清中MDA水平顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05),T-SOD水平顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05),而PC水平有升高趨勢(shì),GSH水平有降低趨勢(shì),但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表3 花旗參茶對(duì)各組小鼠血清中MDA、PC、T-SOD和GSH含量的影響Table 3 Effect of ginseng tea on MDA,PC,T-SOD and GSH in serum of mice in each group

以上結(jié)果說(shuō)明,花旗參茶可劑量依賴(lài)性地降低乙醇氧化損傷小鼠血清中脂質(zhì)過(guò)氧化和蛋白質(zhì)氧化水平,提高抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)水平,發(fā)揮顯著的抗氧化作用。西洋參飲片泡水組的給藥劑量(0.500 g生藥/kg)與花旗參茶中劑量(0.550 g生藥/kg)相近,但其對(duì)抗氧化相關(guān)指標(biāo)的改善程度只與花旗參茶低劑量(0.275 g生藥/kg)相當(dāng),說(shuō)明在同等劑量下,花旗參茶對(duì)氧化損傷的改善效果優(yōu)于西洋參飲片泡水。

由表4可知,與模型組比較,參茶低、中、高3個(gè)劑量組和飲片泡水組肝組織中MDA和PC水平極顯著降低(P<0.01),T-SOD和GSH水平極顯著升高(P<0.01)。與空白對(duì)照組比較,參茶低劑量組肝組織中MDA和PC水平有升高趨勢(shì),中、高劑量組MDA和PC水平有降低趨勢(shì),但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);參茶低劑量組T-SOD極顯著降低(P<0.01),而中、高劑量組T-SOD水平有降低趨勢(shì)但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);參茶低劑量組GSH水平有升高趨勢(shì)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),而中、高劑量GSH水平顯著升高(分別P<0.05,P<0.01);飲片泡水組肝組織中的MDA、PC和GSH水平有升高趨勢(shì),T-SOD水平有降低趨勢(shì),但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表4 花旗參茶對(duì)各組小鼠肝組織中MDA、PC、T-SOD和GSH水平的影響Table 4 Effect of ginseng tea on MDA,PC,T-SOD and GSH levels in liver tissues of mice in each group

肝組織中抗氧化相關(guān)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果與上述血清中抗氧化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果一致,進(jìn)一步說(shuō)明花旗參茶具有顯著的抗氧化作用,并且在同等劑量下,花旗參茶對(duì)乙醇誘導(dǎo)氧化損傷的改善效果優(yōu)于西洋參飲片泡水。

2.4 花旗參茶對(duì)小鼠體內(nèi)肝損傷相關(guān)指標(biāo)ALT、AST和TG水平的影響

ALT和AST是臨床上廣泛應(yīng)用于肝功能檢測(cè)的生化指標(biāo),當(dāng)肝細(xì)胞受損變性時(shí),肝細(xì)胞的胞漿釋放ALT到血液中,當(dāng)肝細(xì)胞嚴(yán)重受損、壞死時(shí),肝細(xì)胞的線(xiàn)粒體釋放AST到血液中,使血清ALT或AST含量增加,在肝功能檢查中,ALT、AST分別是反映肝細(xì)胞受損、肝細(xì)胞壞死的指標(biāo)[23];肝臟是合成、貯存TG的場(chǎng)所,TG含量偏高指示脂質(zhì)的沉積[24]。

由表5可知,與空白對(duì)照組比較,模型組小鼠血清ALT、AST和TG水平極顯著升高(P<0.01),說(shuō)明50%乙醇可造成肝臟急性損傷和脂質(zhì)沉積。與模型對(duì)照組比較,參茶3個(gè)劑量組和飲片泡水組血清中ALT水平極顯著降低(P<0.01),AST水平顯著降低(參茶3個(gè)劑量組P<0.01,飲片泡水組P<0.05);參茶中、高劑量組血清TG水平極顯著降低(P<0.01),而參茶低劑量組和飲片泡水組TG水平只有降低趨勢(shì)。與空白對(duì)照組比較,參茶中、高劑量組的ALT水平略有升高,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),但參茶低劑量組和飲片泡水組血清ALT水平顯著高于空白組(分別P<0.05,P<0.01);參茶3個(gè)劑量組和飲片泡水組血清AST水平均極顯著高于空白組(P<0.01);參茶3個(gè)劑量組和飲片泡水組血清TG水平均略高于空白組,但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05),見(jiàn)表5。以上結(jié)果說(shuō)明,花旗參茶可減少乙醇誘導(dǎo)肝損傷小鼠的肝細(xì)胞中轉(zhuǎn)氨酶和TG的釋放,可能是通過(guò)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性,減少脂質(zhì)堆積,保護(hù)肝臟。在同等劑量下,花旗參茶對(duì)乙醇誘導(dǎo)肝損傷的改善效果優(yōu)于西洋參泡水。

表5 花旗參茶對(duì)各組小鼠血清中ALT、AST和TG水平的影響Table 5 Effect of ginseng tea on ALT,AST and TG levels in serum of mice in each group

2.5 花旗參茶對(duì)小鼠肝損傷的病理分析

酒精導(dǎo)致的肝臟損傷除了轉(zhuǎn)氨酶和TG的水平改變,也會(huì)造成肝細(xì)胞凋亡和產(chǎn)生炎癥[25]。HE染色結(jié)果顯示(圖1),空白對(duì)照組小鼠肝臟結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞正常;50%乙醇造模后,模型組小鼠肝組織出現(xiàn)明顯的細(xì)胞空泡變性、壞死、胞質(zhì)疏松淡染、細(xì)小泡沫樣,且少數(shù)肝細(xì)胞嗜酸性增強(qiáng),胞質(zhì)內(nèi)有伊紅染半透明小體,指示存在炎癥。與模型組比較,參茶低劑量組肝損傷程度與模型組無(wú)明顯差異,中、高劑量組小鼠肝損傷程度較模型組輕,高劑量改善效果最明顯;西洋參飲片泡水組損傷程度嚴(yán)重,未見(jiàn)明顯改善。與空白對(duì)照組比較,參茶低、中、高劑量組小鼠肝組織出現(xiàn)細(xì)胞變性壞死、炎性浸潤(rùn)等不同程度損傷,高劑量改善效果最好;西洋參飲片泡水組小鼠肝組織出現(xiàn)細(xì)胞變性壞死和炎性浸潤(rùn),損傷程度嚴(yán)重。說(shuō)明中、高劑量的花旗參茶可減輕乙醇誘導(dǎo)肝損傷小鼠的肝臟炎癥和維持肝細(xì)胞正常結(jié)構(gòu),高劑量組的改善效果最明顯。

圖1 各組小鼠肝組織HE染色病理分析圖(200×)Fig.1 Pathological analysis of HE staining of liver tissues of mice in each group(200×)注:1為細(xì)胞變性;2為細(xì)胞壞死;3為強(qiáng)嗜酸性細(xì)胞;4為嗜酸性小體。

3 結(jié)論與討論

乙醇在體內(nèi)經(jīng)過(guò)一系列生物代謝過(guò)程,產(chǎn)生乙醛等有害物質(zhì),導(dǎo)致氧化應(yīng)激,對(duì)肝臟等器官造成損傷[26]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立乙醇氧化損傷小鼠模型,檢測(cè)血清和肝組織中MDA、PC、T-SOD和GSH的含量,評(píng)估花旗參茶的抗氧化作用;通過(guò)檢測(cè)血清中ALT、AST和TG含量,并結(jié)合病理觀察,評(píng)估花旗參茶對(duì)肝損傷的改善作用。結(jié)果表明,花旗參茶和西洋參飲片泡水可通過(guò)抑制機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化和蛋白質(zhì)氧化、提高抗氧化酶活性和抗氧化物水平,并減輕肝組織空泡變性和炎癥反應(yīng)等病理改變,進(jìn)而減輕乙醇對(duì)機(jī)體的氧化損傷和急性肝損傷。另有研究表明,西洋參對(duì)電離輻射導(dǎo)致的小鼠氧化損傷具有保護(hù)作用[27],對(duì)對(duì)乙酰氨基酚和環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的小鼠肝損傷具有保護(hù)作用[28-29],說(shuō)明西洋參具有確切的抗氧化和肝保護(hù)作用,與本文用乙醇誘導(dǎo)小鼠氧化損傷和肝損傷模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

花旗參茶通過(guò)降低乙醇氧化損傷小鼠體內(nèi)MDA、PC水平,升高SOD、GSH水平,維持氧化與抗氧化平衡,減少肝組織中的ALT、AST和TG釋放到血液,并減輕肝組織中肝細(xì)胞壞死、變性、炎性浸潤(rùn)等病理改變,從而發(fā)揮顯著的抗氧化和保護(hù)乙醇急性肝損傷作用。在同等劑量下,花旗參茶的抗氧化作用和保護(hù)肝損傷作用優(yōu)于西洋參飲片。本研究只對(duì)花旗參茶抗氧化和保肝的作用機(jī)制進(jìn)行了探討,而其調(diào)節(jié)免疫、抗疲勞等作用及作用機(jī)制尚待下一步繼續(xù)研究。后續(xù)可通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接等技術(shù),深入挖掘花旗參茶抗氧化、保肝等作用的有效成分、作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路,并通過(guò)相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,以更深入、更全面闡明花旗參茶的保健作用機(jī)制。