菊苣、葛根、桑葉配方對高尿酸合并關節炎小鼠的降尿酸和痛風性關節炎的干預效果

吳美音,陳淑寧,高 潔,*,裴超穎,林偉杰,陳有軍

(1.廣州宏韻醫藥科技股份有限公司,廣東廣州 510000;2.廣州中醫藥大學,廣東廣州 510006)

痛風(Gout)是一種由于嘌呤代謝紊亂而導致人體內尿酸過度分泌或排泄不足所引起的疾病,臨床上以痛風性關節炎最為常見。在過去的幾十年里,痛風的發病率逐年上升,且發病人群逐漸年輕化,城市和沿海地區尤甚[1-3]。因此,開展對痛風預防和治療的研究也成為了當前的熱點。目前,臨床上治療高尿酸血癥痛風主要有別嘌呤醇等藥物,其雖能夠較快緩解痛風癥狀,但只有不到一半的高尿酸血癥患者血清UA水平能夠得到有效控制,且肝腎損害、過敏等副作用也較為突出[4-5]。本研究主要以療效確切的菊苣、葛根和桑葉構成配方,探究其降低尿酸水平,減輕炎癥反應及提升安全性的效用。

菊苣(CichoriumintybusL.)為菊科植物毛菊苣或菊苣的干燥地上部分或根,是一種常見的藥食兩用中藥材。菊苣性涼而味微苦、咸,具有清肝利膽,利尿消腫之效,臨床常用于濕熱黃疸,水腫尿少之患[6]。現代藥理學研究表明,菊苣中主要含有酚酸類、香豆素、倍半萜等化學成分,具有降血糖、降尿酸、保肝等作用[7-9]。葛根是豆科植物野葛[Puerarialobata(Willd.)Ohwi]的干燥根,是常見的治療糖尿病及其并發癥的中藥組分[10],不僅如此,研究表明葛根能明顯緩解大鼠痛風性關節腫脹程度,同時還具有降尿酸和修護脾、腎的作用[11]。桑葉[Mulberry(L.)leaf]為桑科植物桑的干燥葉,其含有的黃酮類成分被證明具有調節糖脂代謝異常,減輕炎癥,抑制尿酸代謝中黃嘌呤氧化酶的作用[12-14]。由此可見,這三種中藥在調節代謝,保護肝腎及抑制炎性方面相得益彰,同時上述配方屬于衛計委公布的既是食品又是藥品的中藥,可以得到更加有效的利用。因此本課題推測三藥等配伍組方針對痛風在降低尿酸水平,減少肝腎損傷及炎癥方面會有更好的療效,且目前尚無將上述三種藥物組方研究的相關報道。

本研究采用氧嗪酸鉀誘導小鼠高尿酸血癥模型和尿酸鈉誘導小鼠痛風關節炎模型,研究主要由菊苣、葛根及桑葉組成的組方的的降尿酸和抗痛風作用,并進一步探討藥物發揮功效可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明種小鼠 雄性,SPF級,體質量(20±2) g,廣東省醫學實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(粵)2019-0035,廣州中醫藥大學動物中心飼養,許可證號:SYXK(粵)-20180084;菊苣、葛根、桑葉、余甘子、玉米須等 批號:20181015,廣州宏韻醫藥科技股份有限公司;尿酸鈉(MSU)(批號:102369021)、氧嗪酸鉀(PO)(批號:101469031)、別嘌呤醇(批號:1001767673) 美國Sigma化學公司;組方固體飲料 批號:20181015,廣州宏韻醫藥科技股份有限公司,主要配方:菊苣、葛根、桑葉等;羧甲基纖維素鈉(sodium carboxyl methyl cellulose,CMC-Na) 批號:201424,上海麥克林公司;尿酸(UA)試劑盒(批號:20181025)、黃嘌呤氧化酶(XOD)試劑盒(批號:20181023)、谷草轉氨酶(AST)試劑盒(批號:20181021)、谷丙轉移酶(ALT)試劑盒(批號:20181021)、肌酐(CRE)試劑盒(批號:20180928)、尿素氮(BUN)試劑盒(批號:20180927) 以上生化試劑盒均由南京建成生物工程研究所生產。

1510型全波長酶標儀、Fresco 70型冷凍高速離心機 德國Thermo Fisher公司;OLYMPUS光學顯微鏡 日本奧林巴公司;核酸電泳儀 Bio-rad公司;BS300型紅外溫度計 中科紅外科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物模型復制、分組及給藥方法 將50只小鼠適應性飼養一周后,隨機分為5組,每組10只,即空白組、模型組、別嘌醇陽性組(5 mg·kg-1)、配方高、低劑量組(2.67、1.33 g·kg-1),動物以每日12 h光照,相對濕度50%～80%,應用消毒水和標準飼料嚴格飼養;每日先造模,造模是以PO誘導高尿酸,連續腹腔注射15 d(0.25 g·kg-1);其中空白組注射等劑量溶劑0.5% CMC-Na;自第9 d起每兩日關節腔注射一次尿酸鈉(25 mg·mL-1尿酸鈉晶體混懸液),以誘導小鼠痛風性關節炎。造模完成后各組每日灌胃上述劑量藥物,空白組及模型組給予等容積的蒸餾水,連續15 d。

1.2.2 血清代謝及炎癥因子指標檢測 在實驗的第15 d晚上,小鼠禁食過夜;第16 d早上小鼠吸入乙醚麻醉,以含有EDTA真空采血管自下腔靜脈采血。全血于3500 r·min-1(-4 ℃)低溫離心15 min,分離血清。按試劑盒說明測定血清中UA及XOD、AST及ALT、CRE及BUN、IL-1β及TNF-α的水平。

1.2.3 小鼠關節炎癥指數及腫脹度檢查 自第9 d起,關節腔注射尿酸鈉后,每日采用紅外溫度計拍攝腫脹關節的溫度,并依據標準計算炎癥指數。其標準如下:0級踝關節正常,局部皮膚顏色及膚溫未見明顯改變(10分);Ⅰ級踝關節表面紅斑,關節輕度腫脹踝關節骨性標志清晰可見(8分);Ⅱ級踝關節明顯腫脹,局部顏色稍紅,踝關節骨性標志模糊,踝關節腫脹范圍僅限于踝關節局部(4分);Ⅲ級踝關節局部腫脹且踝關節以外部位肢體出現腫脹(0分)。第16 d用游標卡尺測量小鼠雙足關節的最大直徑并計算關節腫脹度。注:為了盡量保證測量的準確性,整個實驗過程均由同1個人操作,每組重復測量3次并求取平均值。關節腫脹度=(小鼠右膝關節周徑-左膝關節周徑)/左膝關節周徑。

1.2.4 肝臟、腎臟及關節組織病理學觀察 第16 d采血完成后,動物麻醉后頸部脫臼處死,解剖其肝臟、腎臟及腫脹關節,肝腎精密稱重后,取一小塊快速用4%的多聚甲醛溶液固定,關節直接固定,其余肝腎組織凍存;肝腎組織固定48 h后使用系列乙醇脫水,用石蠟包埋,而后切成4 μm石蠟切片,石蠟烘干后用蘇木精和伊紅進行病理染色。關節組織則先進行脫鈣處理,后續實驗流程與肝腎組織的流程一致。各組織病理均用光學顯微鏡(OLYMPUS,Japan)200×放大觀察并拍照。

1.2.5 腎臟尿酸鹽轉運體(URAT1)的檢查 各組取約50 mg腎臟組織于1 mL EP管中,裂解液與蛋白酶抑制劑按1∶100比例配制,各EP管加入300 μL配制溶液后勻漿。勻漿經充分裂解后于4500 r·min-1(-4 ℃)離心機低溫離心15 min,分離上清后取微量上清液稀釋20倍用碧云天的BCA試劑盒測定各組蛋白濃度,蛋白樣品和加樣緩沖液于4∶1的比例混合后高溫煮8 min至蛋白變性。蛋白提取完成后,分裝至-20 ℃保存待用。而后使用康為的配膠試劑盒配置8%和10%的SDS-PAGE電泳凝膠,各組蛋白樣品上樣后在凝膠中分離,而后300 mA轉膜1.5 h。轉膜完成后,將膜在室溫下用5%脫脂牛奶封閉,經TBS-Tween洗滌3次后,URAT1抗體按1∶1000稀釋后進行孵育,4 ℃過夜。第2 d,用TBS-Tween洗滌3次后在室溫下用二抗孵育1 h,洗滌后用ECL發光液進行顯色,拍照并使用Image J軟件進行密度分析。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 小鼠一般狀況評價

尿酸鈉造模前,各組小鼠皮毛有光澤,精神狀態良好,活動性好,攝食攝水正常,體重增加;進行尿酸鈉造模干預后,模型組各組小鼠出現毛色變黃,光澤度降低,攝食量減少,右踝關節局部皮膚溫度增高,小鼠不喜動。另外,各組動物關節造模后踝關節腫脹,除正常組外,其余各組動物因動物個體差異,造模后有1～2只小鼠關節腫脹后發炎,表現出不喜動,后期甚至不進食,而后導致死亡。

2.2 組方對小鼠血清中UA、XOD水平的影響

由表1，圖1和圖2可知，與正常組比較,模型組血清UA、XOD水平,腎臟URAT1蛋白表達極顯著升高(P<0.01),提示高尿酸模型造模成功;與模型組比較,組方高、低劑量組的UA、XOD水平極顯著降低(P<0.01),URAT1蛋白水平也顯著下降(P<0.05)。

表1 組方對小鼠血清中UA、XOD含量的影響Table 1 Effects of component on serum UA,XOD

圖1 組方對小鼠腎臟中URAT1蛋白表達的影響Fig.1 Effects of component on URAT1 protein expression in kidney of

圖2 小鼠腎臟中URAT1蛋白表達的統計Fig.2 Expression of URAT1 protein in kidney of mice注:與正常組比較:## P<0.01;與模型組比較,* P<0.05,** P<0.01。

2.3 組方對小鼠血清中AST、ALT、CRE及BUN水平的影響

由表2可知，與正常組比較,模型組小鼠血清AST、ALT含量的極顯著升高(P<0.01)，提示持續的高尿酸可引起肝臟損傷;同樣地,CRE、BUN含量也極顯著升高(P<0.01),說明尿酸水平的升高也造成了腎損傷。與模型組比較,組方高、低劑量組的AST、ALT、CRE及BUN含量均顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。

表2 組方對小鼠血清中AST、ALT、CRE及BUN含量的影響Table 2 Effects of component on serum AST,ALT,CRE,BUN

2.4 組方對小鼠肝臟、腎臟病理組織學的影響

由圖3可知，正常組小鼠肝臟結構正常,肝小體邊界明顯且大小正常;模型組肝小體包漿破碎,邊界十分不明顯,有較大的炎癥浸潤;與模型組相比,組方高、低劑量組中肝組織皆有不同程度的改善,肝小體、肝小葉相對完整,細胞水腫面積縮小、未出現晶體沉淀現象;相比低劑量組,組方高劑量組的肝小體邊界更為明顯,炎癥浸潤更少。

圖3 組方對高尿酸血癥小鼠肝、腎臟病理組織學的影響(HE,200×)Fig.3 Histological analysis of mice liver and kidney tissues of different groups(HE staining,200×)

腎臟病理圖中,正常組小鼠腎小管無腫脹擴張現象,腎小球性狀、大小均正常;模型組腎小管腫大,出現蛋白管,透明管形,炎癥浸潤明顯,或有些許晶體小塊嵌于組織;組方高、低劑量組病理改變均不明顯,腎臟結構基本正常,細胞水腫面積縮小、炎癥浸潤相對較少。

2.5 組方對小鼠右踝關節炎癥指數的影響

由表3可知，與正常組相比,模型組在各時間觀察踝關節炎癥指數均升高,表示尿酸鈉致小鼠急性痛風性關節炎造模成功;各組小鼠在造模后12 h踝關節炎癥指數達到峰值,同人類痛風性關節炎急性發作情況類似;與模型對照組比較,陽性藥物別嘌醇組、組方高、低劑量組給藥后關節炎指數均有不同程度降低,造模后24 h炎癥指數下降尤其明顯。

表3 小鼠右踝關節炎癥指數觀察結果Table 3 Observation results of inflammatory index of right ankle joint in mice

2.6 組方對小鼠關節腫脹度和關節溫度變化的影響

由表4可知，與空白組比較,模型組小鼠關節腫脹度及腫脹部位溫度極顯著增加(P<0.01),表示關節腔注射尿酸鈉可致小鼠急性痛風性關節炎;同模型組比較,組方高劑量組小鼠的關節腫脹度顯著降低(P<0.05);組方高、低劑量組的關節紅外溫度均極顯著降低(P<0.01)。

表4 組方藥物對小鼠關節腫脹度和關節溫度變化的影響Table 4 Effect of component on joint swelling

2.7 組方對小鼠血清中炎癥因子IL-1β及TNF-α的含量影響

由表5可知，與正常組比較,模型組中炎癥因子IL-1β、TNF-α的表達水平極顯著升高(P<0.01),提示高尿酸可能導致炎癥;與模型組比較,組方高劑量組的IL-1β顯著降低(P<0.05);組方高、低劑量組的TNF-α水平極顯著降低(P<0.01)。表5的炎癥指標結果與表3、表4表觀關節炎癥程度基本對應,提示組方組有較明顯的抗炎作用。

表5 組方對小鼠血清中IL-1β及TNF-α含量的影響Table 5 Effect of component on serum IL-1β,TNF-α

2.8 組方對小鼠關節病理組織學的影響

如圖4所示,正常組滑膜上皮細胞結構光滑完整,未見細胞増生病變,極少量炎細胞浸潤周邊組織;模型組的關節中,滑膜上皮細胞增生約3層,大量炎癥細胞浸潤踝關節滑膜及周邊組織,有水腫等病變情況,關節炎癥浸潤密集且有關節腔內滲出物;陽性組別嘌醇組滑膜上皮細胞與正常對照組近似,其滑膜組織并未出現增生,軟組織呈少許炎癥浸潤,軟骨面、關節腔無病變現象;組方高、低劑量組功效相當,滑膜組織出現單層增生,軟組織有炎癥浸潤,軟骨面未出現病變;關節炎癥浸潤較少,未觀察到關節腔內滲出物。

圖4 組方對痛風性關節炎小鼠關節病理組織學的影響(HE,200×)Fig.4 Histological analysis of mice joint tissues of different groups(HE staining,200×)

3 討論與結論

本研究選用PO和尿酸鈉誘導小鼠高尿酸合并痛風模型,并以別嘌呤醇為陽性對照組,對組方的療效及安全性進行全面的評價。動物整體狀態、尿酸水平、肝腎損傷、炎癥因子水平等多個指標的變化,均指示該模型符合預期模型病理改變特點,該模型構建良好。UA是人體嘌呤核苷酸代謝的終產物,主要經肝臟中廣泛分布的黃嘌呤氧化酶(XOD)催化合成,再經腎臟排泄。XOD是該過程中的關鍵限速酶,其水平越高,表明產生的UA越多[15-17]。URAT1是尿酸排泄關鍵轉運蛋白,主要位于腎皮質近曲小管的上皮細胞刷狀緣,介導尿酸鹽從腎小管腔向血液的再吸收,對人體腎臟調節尿酸水平具有重要生理學意義,是促尿酸排泄藥物研究的重要靶點[18-19]。實驗表明,與模型組比較,組方高劑量組的UA、XOD水平極顯著降低(P<0.01),URAT1蛋白水平也有顯著下降(P<0.05),提示該組方可能通過抑制XOD水平,促進尿酸排泄,從而減低血尿酸濃度,達到治療痛風的療效。除此之外,持續的高尿酸可引起肝、腎功能損傷,測定肝臟ALT/AST、腎臟CRE/BUN可反映小鼠的肝腎保護或損傷情況[20],本研究組方治療小鼠高尿酸合并痛風模型15 d后,與模型組比較,組方高、低劑量組的AST、ALT、CRE及BUN含量均顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01),且肝、腎組織形態良好,顯示較好的肝腎保護作用。

尿酸和尿酸鹽在關節、腎臟的沉積會導致單核巨噬細胞黏附滲出,釋放炎性因子。IL-1β是痛風急性發作的關鍵因子,TNF-α是炎癥反應過程出現的最早、最重要的炎性因子,是炎癥的啟動子,也是持續炎癥反應的誘發因子[21-25]。炎癥因子IL-1β及TNF-α的表達水平的升高提示體內持續炎性反應程度也較高。實驗結果顯示,與模型組比較,組方高劑量組的IL-1β水平顯著降低(P<0.05);組方高、低劑量組的TNF-α水平極顯著降低(P<0.01),提示組方可能通過抑制炎癥因子的趨化和聚集,從而達到減輕炎癥反應的作用。小鼠關節腫脹度、關節溫度、關節病理表現的改善也進一步說明了該組方具有較好的關節保護作用。

本研究從動物水平和分子生物學水平證實了,由菊苣、葛根及桑葉為主要成分的組方對PO誘導的高尿酸血癥合并關節炎小鼠具有降尿酸、關節保護及肝腎保護作用,其作用機制可能與改善肝腎損傷,降低血清尿酸以及減少URAT1蛋白的表達相關,可為進一步開發該組方產品提供實驗基礎。