五味子、黃芪混合多糖對大鼠高脂血癥的降脂作用

楊 波,許智瑩,林程程,李 賀,孫靖輝,陳建光,王春梅

(北華大學藥學院藥理教研室,吉林吉林 132013)

天然植物多糖分子結構復雜,分子量大,與蛋白質和核酸一樣,是生命物質的重要組成成分。近年來多糖以其資源來源廣泛、藥理活性豐富、毒副作用小等優勢越來越受到人們的關注。大量研究表明,植物多糖具有調節免疫、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、調節血脂等多種功效[1-4]。因此,以植物多糖為主要原料,采用現代工藝技術研發出高效低毒的大健康食品已成為廣大學者的目標。

五味子是長白山道地藥材,是《神農本草經》中最早被列為上品的著名滋補藥。五味子的酸、苦、甘、辛、咸五種藥性,可以很好的調節機體五臟功能,是開發保健食品的理想資源,已被列為國家保健食品可用原料目錄。多糖是五味子的主要活性成分之一,不僅具有護肝降脂、抗氧化、保護心血管、調節免疫等多種藥理活性,且具有含量高、毒性低等優點,極具開發價值[5-7]。課題組前期工作已證明,五味子多糖具有降脂減肥、抗氧化等作用,對高脂飲食誘導的非酒精性脂肪性肝病及2型糖尿病動物模型的脂代謝紊亂均具有顯著的改善作用[8-10]。黃芪是中醫臨床常與五味子配伍使用的大宗藥材之一。多糖作為黃芪的主要有效成分,具有突出的免疫調節、抗氧化、抗衰老、保護心血管等保健功效[11-13]。近年研究也表明黃芪多糖可降低高脂血癥大鼠血TC、LDL-C、TG水平,增加大鼠糞便膽固醇及膽汁酸排泄,減輕肝臟內脂質沉積,降低脂質過氧化水平等[14-15],顯示出良好的降血脂作用。然而,五味子與黃芪混合多糖是否具有調節血脂作用,還未見報道。因此,課題組將五味子和黃芪按比例混合,提取多糖成分,建立高脂飲食誘導高脂血癥大鼠模型,研究五味子黃芪混合多糖(Polysaccharide from mixedSchisandrachinensisandAstragalusmembranaceus,SAP)的降脂作用,并探討其作用機制,為開發新型降脂保健食品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五味子 吉林省集安市五味子種植基地;中藥飲片黃芪 河北祁新中藥顆粒飲片有限公司;低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、膽固醇(Total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、甘油三酯(Triglyceride,TG)試劑盒 北京普利萊基因技術有限公司;RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司;GAPDH、肝X受體α(Liver X receptorsα,LXRα)、ATP結合盒轉運蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)、三磷酸結合盒轉運體 G1(ATP-binding cassette G1,ABCG1)抗體 武漢ABclonal 公司;雄性Wistar大鼠 合格證號:SCXK(吉)2018-0001,體質量(200±10) g;基礎飼料和高脂飼料成分配比見參考文獻[9] 長春億斯實驗動物技術有限責任公司。

5418R型冷凍離心機 德國Eppendorf公司;Infinite M200酶標儀 瑞士Tecan集團;PowerPac型Western blot電泳儀和轉膜儀 美國Bio-Red公司;PS普諾森FluorChem M成像系統 美國Protein Simple公司;旋轉蒸發儀 上海申生科技有限公司;KDM型調溫電熱套 山東鄄城華魯電熱儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 五味子、黃芪混合多糖的提取及含量測定 SAP提取的具體方法參照課題組之前的報道[16]。具體為五味子和黃芪(1∶3,w/w)粉碎置于圓底燒瓶中,加入45倍體積蒸餾水,放入KDM型調溫電熱套中,100 ℃條件下加熱3 h,使多糖被充分浸提。過濾并收集濾液,用旋轉蒸發儀濃縮濾液(70 ℃)至濃黏液,冷卻后加入95%乙醇,使乙醇終濃度為75%(用酒精計測定),4 ℃冰箱中靜置過夜。將離心(4500 r/min,10 min)后得到的沉淀用無水乙醇清洗,水浴蒸干,得到粉末狀SAP。采用苯酚-硫酸比色法檢測SAP中的粗多糖含量[17],經計算,SAP的得率為14.62%,SAP中糖含量為46.34%。

1.2.2 動物實驗分組與處理 32只SPF級雄性Wistar大鼠,隨機分為空白組(CON)、空白給藥組(CON+SAP)、模型組(HFD)、五味子黃芪混合多糖治療組(HFD+SAP),共4組,每組8只。HFD組和HFD+SAP組均采用高脂飼料喂養誘導高脂血癥大鼠模型。同時,CON+SAP組和HFD+SAP組以灌胃方式給予SAP(100 mg/kg),CON組和HFD組給予同體積的蒸餾水,每日給藥一次,持續8周,每周記錄大鼠體重。

1.2.3 大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C含量的測定 最后一次給藥12 h后對大鼠進行乙醚麻醉,經腹主動脈取血,離心10 min(3500 r/min,4 ℃),收集血清。采用試劑盒測定大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C含量[18]。

1.2.4 大鼠肝臟中TC、TG含量的測定 上述大鼠經采血后,分離出肝臟,用4 ℃預冷的生理鹽水洗滌,濾紙吸干后部分保存在-80 ℃冰箱中,另一部分用于組織病理學檢查。取100 mg大鼠肝組織,加入9倍體積生理鹽水,制成10%肝組織勻漿,采用試劑盒測定大鼠肝組織中TC、TG含量。

1.2.5 組織形態學觀察 將用于組織病理學檢查的大鼠肝組織置入10%中性福爾馬林溶液中固定,常規石蠟包埋,切成厚度約為5 μm切片,進行蘇木精-伊紅染色[19],于顯微鏡下觀察肝細胞病理形態。

1.2.6 Western blot分析 將蛋白酶抑制劑加入到RIPA蛋白裂解液中(1∶100,V/V),混勻后用于組織蛋白裂解。取50 mg大鼠肝臟組織,加入450 μL配好的組織蛋白裂解液,剪碎,并置于冰上裂解1 h。離心10 min(12000 r/min,4 ℃),取上清。通過BCA法測定上清液中蛋白濃度。將蛋白質樣品煮沸5～10 min使其變性,用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離,然后轉移到PVDF膜。將膜在5%脫脂牛奶中封閉2 h,然后分別與抗ABCA1、LXRα和ABCG1抗體孵育12 h(4 ℃)。將膜用TBST洗滌三次,每次10 min,然后在室溫下與相應的二抗(1∶5000,V/V)溫育1 h。加入ECL發光液,在化學發光成像儀器上觀察條帶并拍照,使用灰度分析軟件計算各目的蛋白的相對表達量,結果用目的蛋白/內參GAPDH表示。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 SAP對高脂血癥大鼠體重的影響

圖1所示為各組實驗大鼠的體重變化情況。實驗開始時4組大鼠之間體重趨于平衡。大鼠喂養3周內,與CON組比較,HFD組大鼠體重增加但無顯著性差異。實驗第4～8周,HFD組大鼠體重顯著高于CON組(P<0.05),并且體重持續上升。這與郭彩霞等[20]的研究結果一致,表明高脂飲食可導致大鼠體重增加。

圖1 SAP對大鼠體重的影響Fig.1 Effects of SAP on body weight of rats注:與CON組比較,#代表差異顯著,P<0.05;與HFD組比較,*代表差異顯著,P<0.05;表1～2、圖2～3同。

與HFD組比較,當SAP治療6周時,HFD+SAP組大鼠體重降低且具有顯著性差異(P<0.05),隨著治療時間的增加,SAP對高脂血癥大鼠體重的降低作用越來越明顯。表明SAP能有效抑制高脂飲食誘導大鼠體重的升高,而對正常組大鼠體重沒有明顯影響。

2.2 SAP對高脂血癥大鼠血脂水平的影響

長期高脂膳食會誘導機體發生脂代謝紊亂,使血液中TC、TG和LDL-C含量增加,HDL-C含量降低[21]。因此,血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平被認為是診斷高脂血癥的重要指標[22]。由表1可知,與CON組比較,HFD組大鼠血清中TC、TG及LDL-C水平顯著增加(P<0.05),HDL-C水平顯著降低(P<0.05),提示本研究中高脂飲食成功誘導了高脂血癥大鼠模型。與HFD組比較,HFD+SAP組大鼠血清中TC、TG及 LDL-C水平顯著降低(P<0.05),HDL-C水平顯著增加(P<0.05),表明SAP可以改善高脂血癥大鼠的血脂異常。同時研究發現CON+SAP組大鼠血清中TC、TG、LDL-C及HDL-C水平與CON組比較,沒有明顯變化,表明SAP對正常大鼠血脂水平無明顯影響。

表1 SAP對大鼠血脂的影響(n=8,mmol/L)Table 1 Effects of SAP on blood lipids in rats(n=8,mmol/L)

2.3 SAP對高脂血癥大鼠肝臟TC、TG水平的影響

肝臟是機體脂質代謝的主要場所,長期高脂飲食會導致脂質在肝臟沉積。由表2可知,HFD組大鼠肝組織中TC和TG水平顯著高于CON組(P<0.05);與HFD組比較,HFD+SAP組大鼠肝組織中TC和TG水平顯著降低(P<0.05),表明SAP處理可以降低肝組織中TC和TG水平,減輕脂質在肝臟的沉積,緩解肝臟脂代謝紊亂。

表2 SAP對大鼠肝臟TC、TG水平的影響(n=8,mmol/gprot)Table 2 Effects of SAP on TC and TG levels of liver in rats(n=8,mmol/gprot)

2.4 SAP對高脂血癥大鼠肝臟組織病理學的影響

不同處理組大鼠的肝臟組織HE染色結果如圖2所示,CON組大鼠肝小葉結構及肝細胞形態均正常;與CON組比較,HFD組大鼠肝血竇界限不清,肝細胞胞漿內可見空泡,有的空泡互相融合為大的脂肪空泡,表明高脂飲食可使大鼠肝臟產生病理性變化。與HFD組比較,HFD+SAP組胞漿內空泡明顯減輕,肝血竇清晰可見,表明SAP可以減輕高脂大鼠肝臟脂質沉積,而對正常組大鼠肝組織形態沒有明顯影響。

圖2 SAP對大鼠肝臟病理形態的影響(HE,×200)Fig.2 Effect of SAP on liver pathomorphology of rats(HE,×200)

2.5 SAP對高脂血癥大鼠肝組織中膽固醇代謝相關蛋白表達的影響

肝X受體(Liver X receptors,LXRs)在維持機體脂代謝平衡尤其是膽固醇穩態中具有重要的作用[23]。其亞型LXRα被稱為膽固醇感受器,可以通過調控膽固醇代謝過程進而維持體內膽固醇含量穩定。當LXRα被激活后,可增加其下游靶基因ATP結合盒轉移子家族相關蛋白如ABCA1和ABCG1的表達,促進膽固醇逆轉運。因此,需要對肝組織中LXRα的表達進行檢測。結果如圖3A和圖3B所示,與CON組比較,HFD組大鼠肝組織中LXRα蛋白水平顯著降低(P<0.05);表明長期高脂飲食可顯著抑制LXRα的表達,導致組織內膽固醇蓄積。而與HFD組比較,HFD+SAP組大鼠肝組織中LXRα蛋白表達顯著增加(P<0.05),提示SAP可能通過上調LXRα的表達增加膽固醇外流。

圖3 SAP對高脂血癥大鼠LXRα、ABCA1和ABCG1蛋白表達的影響Fig.3 Effects of SAP on the expression of LXRα,ABCA1,and ABCG1 proteins in rats with hyperlipidemia

研究表明,ATP結合盒轉運蛋白A1(ABCA1)是膽固醇逆轉運(Reverse cholesterol transport,RCT)過程中的關鍵調節因子,在細胞內全部膽固醇流出中,有2/3是由ABCA1介導的[24]。ABCA1主要促進磷脂和膽固醇向載脂蛋白A-I(ApolipoproteinA-Ⅰ,apoA-I)轉運,形成新生的 HDL-C,進而啟動RCT,加速膽固醇的流出[25-26]。同時,有研究顯示ABCG1是參與RCT過程的另一主要因子,負責介導細胞內膽固醇流向成熟HDL,隨著血液系統聚集到肝臟,排出體外[27]。如圖3C、圖3D所示,與CON組比較,HFD組大鼠肝組織中ABCA1和ABCG1蛋白水平顯著降低(P<0.05);與HFD組比較,HFD+SAP組大鼠肝組織中ABCA1和ABCG1表達水平顯著增加(P<0.05),提示SAP可能通過激活LXRα,增加ABCA1和ABCG1的表達,進而促進膽固醇的逆向轉運。

3 結論

本研究將五味子和黃芪配伍,提取其混合多糖,通過建立高脂飲食誘導的高脂血癥大鼠模型來研究SAP對脂代謝紊亂的調節作用及其機制。結果顯示SAP可顯著降低高脂血癥大鼠體重、血清及肝臟中TC和TG水平,減輕肝臟脂質沉積,改善脂代謝紊亂,對高脂血癥具有顯著的治療作用。同時,SAP通過上調肝臟膽固醇代謝相關蛋白LXRα、ABCA1和ABCG1的表達,促進膽固醇的逆轉運。這為五味子和黃芪配伍使用開發輔助降血脂類保健食品提供了理論依據。