瞬時受體電位香草酸亞型1基因多態性與小兒哮喘的關系

周 毅 劉衛紅 侯梅榮

哮喘是一種以慢性氣道炎癥、氣道高反應性為主要特征的變態反應性疾病，多種細胞、炎性介質及細胞因子共同參與發病過程，尤其好發于兒童時期。隨著城市化進程的加快與生態環境的不斷惡化，近年來國內各醫院哮喘患兒不斷增加，不僅影響兒童的正常生長發育，亦可對其身心健康產生負面影響[1]。同時，隨著對哮喘發病機制的深入研究，越來越多的學者認為此病與多基因遺傳相關，調查顯示其遺傳度達48%～79%[2]。因此，從遺傳學角度預測哮喘易感體質，篩查哮喘高危兒童及針對性早期干預措施是目前研究的主要方向之一。瞬時受體電位香草酸亞型1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)基因定位于人類17p13染色體，早期國內報道[3]顯示，該基因多態性與兒童非特異性慢性咳嗽、喘息密切相關，國外亦有學者[4]證實TRPV1及相關細胞因子與支氣管哮喘有一定關系。在此背景下，筆者擬進一步分析TRPV1多態性與小兒哮喘的關系，以期為小兒哮喘的病因研究、臨床篩查及干預提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 抽取2018年2～10月平頂山市第一人民醫院住院部及門診的90例哮喘患兒為研究對象(哮喘組)，男性50例，女性40例，年齡3～14歲，平均(9.72±3.05)歲，病程1個月～5年，平均(3.21±1.06)年。納入標準：①年齡3～15歲；②結合肺部聽診、肺功能檢查、實驗室檢查等確診，符合中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組于《支氣管哮喘控制的中國專家共識(2013)》[5]中確定的兒童哮喘診斷標準；③過敏原特異性IgE抗體篩查證實有過敏原；④抗哮喘藥物診斷性治療有效。排除標準：①嚴重上呼吸道感染、肺炎、結核引起的慢性咳嗽以及氣管異物、鼻后滴漏綜合征等引起的支氣管癥狀；②合并呼吸衰竭等其他呼吸系統疾病；③合并先天性心肺疾病、自身免疫性疾病及遺傳性疾病；④合并有慢性消耗性疾病、內分泌、遺傳代謝性疾病及長期或重癥營養不良；⑤臨床病歷資料不全。另選取同期50例入院體檢的健康兒童作為對照(對照組)，男性30例，女性20例，年齡4～15歲，平均(9.53±2.88)歲。兩組研究對象性別構成、年齡均衡可比(P>0.05)。本研究通過了醫院倫理委員會審核。

1.2 研究方法 ①制備模板DNA：所有入選對象抽取靜脈血2 mL，肝素鈉抗凝，常規離心處理，取200 μL血漿用全血基因組DNA提取試劑盒(上海生物工程有限公司)制備基因組DNA模板，操作步驟按說明書要求進行。②引物設計與合成：通過 GeneBank查找和調取TRPV1 3’-UTR目的基因序列，借助Primer premier 5軟件設計引物，由上海生物工程有限公司合成。包括rs222747位點(上游引物 5’-CAGAGACAGAGGGAGTTTGGA-3’，下游引物5’-ACACACAGGCGACGCCA-3’)、rs222748位點(上游引物：5’-TGCTGTCCCAGGACTCTGT-3’，下游引物5’-AGGATCCCAGAGAAGCAAGGA-3’)及rs8065080位點(上游引物5’-CAAGTCCTGGAGCTCATTTCA-3’，下游引物5’-GCCCTGACCCAGGTATGTGTA-3’)的基因型和等位基因。③聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)反應條件：PCR擴增應用PCR(Taq)擴增試劑盒(日本Takara公司)，濃度10 μmol/L的上下游引物各1 μL，2×PCR mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，總反應體系均為25 μL；條件：加熱94℃預變性3 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s(rs222747)/56℃退火30 s(rs222748)/62℃退火30 s(rs8065080)，72℃延伸1 min，30個循環，72℃再延伸5 min。PCR產物長度：rs222747為487 bp、rs222748為486 bp、rs8065080為486 bp。④基因型判斷：經2%的瓊脂糖凝膠電泳后于凝膠成像系統下觀察及判斷基因型(CC、GC、GG、TC、TT等)。

1.3 統計學方法 采用統計學軟件SPSS 19.0分析和處理研究數據，計數資料采取率表示，組間基因型與等位基因分布情況對比進行χ2檢驗；通過顯性模型、隱性模型、共顯性模型擬合進行rs222747、rs222748、rs8065080位點的基因型分析，以多因素logistic逐步回歸模型進行相關基因型或等位基因篩選，以是否發生哮喘為因變量，各基因型為自變量，計算各基因型的危險度及95%CI；以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TRPV1基因型 在哮喘組、對照組中，rs222747、rs222748、rs8065080位點均可檢出3種基因型，即rs222747基因型包括CC、GC、GG，rs222748基因型包括CC、TC、TT，rs8065080基因型包括CC、TC、TT。見圖1。

2.2 兩組研究對象TRPV1基因多態性分布 哮喘組TRPV1基因rs222747位點的3種基因型及等位基因分布與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)；而與對照組比較，哮喘組rs222748位點基因型CC攜帶頻率偏低，TC、TT攜帶頻率偏高；rs8065080位點基因型CC攜帶頻率偏低，TT攜帶頻率偏高；rs222748位點、rs8065080位點的3種基因型及等位基因分布差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1～3。

圖1 各位點酶切電泳結果

表1 兩組研究對象TRPV1基因rs222747位點多態性分布[例(%)]

表2 兩組研究對象TRPV1基因rs222748位點多態性分布[例(%)]

表3 兩組研究對象TRPV1基因rs8065080位點多態性分布[例(%)]

2.3 小兒哮喘基因型危險度分析 在顯性模型、隱性模型、共顯性模型中均未發現rs222747位點與小兒哮喘有關聯(P>0.05)。在顯性模型、隱性模型中均未發現rs222748位點與小兒哮喘有關聯(P>0.05)，在共顯性模型下，rs222748位點攜帶基因型TT的小兒患哮喘的風險是攜帶基因型CC小兒的5.926倍(P<0.05)。在顯性模型下，rs8065080位點攜帶基因型TC+TT的小兒患哮喘的風險是攜帶基因型CC小兒的5.233倍(P<0.05)；共顯性模型下，rs8065080位點攜帶基因型TT的小兒患哮喘的風險是攜帶基因型CC小兒的7.058倍(P<0.05)。見表4～6。

表4 TRPV1基因rs222747位點多態性分析(例)

表5 TRPV1基因rs222748位點多態性分析(例)

表6 TRPV1基因rs8065080位點多態性分析(例)

3 討論

小兒哮喘遺傳因素為重要致病內因，環境因素則是主要外因[6-7]。TRPV1作為瞬態電壓感受器族的一員，也是一種傷害性刺激整合器，能夠被機械刺激、熱刺激、活性氧及細胞內外多種刺激因子等直接或間接激活，并促使細胞鈣離子內流，從而促進病理狀態下呼吸系統的功能調節[8-9]。王強等[10]報道，TRPV1基因3’-UTR多態性是影響中國北京兒童哮喘的重要遺傳因素，并證實室內揮發性有機污染物濃度與TRPV1基因多態性對兒童哮喘易感性影響具有協同作用。Veronesi等[11]在研究中發現，辣椒素顆粒吸入物及多種內源性炎性物質能夠共同作用于呼吸上皮細胞的TRPV1通道，并促使白細胞介素6、白細胞介素8、腫瘤壞死因子等炎性介質大量釋放，并激活分布于呼吸道黏膜的神經TRPV1通道，最終導致喘息、咳嗽。Rehman等[12]的實驗發現，白細胞介素13不僅可使哮喘小鼠肺組織TRPV1表達升高，還能促使支氣管上皮細胞TRPV1表達增加，認為TRPV1基因與哮喘小鼠氣道高反應性、炎癥反應及上皮下纖維化有關。Chen等[13]通過logistic回歸分析證實，TRPV1表達水平、IL-4水平和TRPV1基因rs4790522位點突變是兒童支氣管哮喘的主要危險因素。Baker等[14]也認為TRPV1基因突變與兒童哮喘密切相關。

TRPV1基因位于17p13染色體上，其中rs222747位于此基因第9個外顯子，其位點常可見C/G突變，rs222748、rs8065080位點C/T突變或變異在蛋白水平上均可表現為異亮氨酸與纈氨酸的轉化，此位點的基因多態性與喘息、咳嗽等有關[15-16]。本研究以上述易發生突變的3個位點進行TRPVl基因多態性分析，無論是否有哮喘，rs222747、rs222748、rs8065080位點都可檢出3種基因型，其中哮喘組TRPV1基因rs222747位點的3種基因型及等位基因分布與對照組相比未見明顯差異，而與對照組比較，哮喘組rs222748位點基因型CC攜帶頻率偏低，TC、TT攜帶頻率偏高；rs8065080位點基因型CC攜帶頻率偏低，TT攜帶頻率偏高；rs222748、rs8065080位點的3種基因型及等位基因分布均有明顯差異，初步提示rs222748、rs8065080位點基因突變可能與小兒哮喘相關。進一步進行危險度分析顯示，在顯性模型、隱性模型、共顯性模型中均未發現rs222747位點與小兒哮喘有關聯，而在共顯性模型下，攜帶rs222748基因型TT的小兒患哮喘的風險是攜帶基因型CC小兒的5.926倍；顯性模型下，rs8065080位點攜帶基因型TC+TT的小兒患哮喘的風險是攜帶基因型CC小兒的5.233倍，共顯性模型下，攜帶rs8065080基因型TT的小兒患哮喘的風險是攜帶基因型CC小兒的7.058倍，提示TRPV1基因rs222748、rs8065080位點基因多態性可能與小兒哮喘的易感性有關。目前，臨床未見TRPV1基因多態性與哮喘相關性的最新報道，關于小兒其他呼吸系統疾病，張小寧等[17]的早期研究顯示，TRPV1基因rs222748、rs8065080位點基因多態性與兒童非特異性慢性咳嗽無明顯關系；而Turner等[18]則持不同觀點，認為TRPV1基因rs222748、rs8065080位點基因多態性與兒童咳嗽有關。導致上述觀點差異的原因可能與兒童種族、地區及遺傳背景不同有關，TRPV1基因rs222748、rs8065080位點基因多態性對小兒哮喘的影響機制或許與小兒咳嗽類似，但其具體機制仍需深入探討。

綜上所述，TRPV1基因rs222748、rs8065080位點基因多態性可能與小兒哮喘的易感性有關，或可為小兒哮喘的病因研究、臨床篩查及干預提供一定參考，但TRPV1基因多態性與小兒哮喘的相關性仍需擴大樣本量、多中心的研究以論證。