冠突散囊菌分生孢子產孢條件研究

陳 怡，劉石泉，李滔滔，余松林，汪無忌，胡治遠

(湖南城市學院 黑茶金花湖南省重點實驗室，湖南 益陽413000)

冠突散囊菌(Eurotium cristatum)是散囊菌屬的一種真菌，作為茯磚茶發花過程中的優勢微生物而被人們所熟知，其在茶葉中生長，可代謝轉化茶葉中的化學成分，并生成一系列生理活性物質，有改良茶葉品質和提升保健功效的作用[1]﹒利用冠突散囊菌加工的黑茶或其他發酵產品，在減肥[2]、降脂[3]、抗氧化[4]和調節人體免疫[5]等方面的生理活性作用尤為顯著﹒近年來，冠突散囊菌已成為微生物資源領域研究的熱點，對其生理特性、發酵工藝和分類鑒定等方面的研究較多﹒在人工培養或自然條件下，冠突散囊菌主要通過有性結構子囊孢子進行繁殖[6]，而無性型孢子—分生孢子則鮮少出現；并且其分生孢子呈較淺的灰綠色[7]，常規培養基上不易被觀察到，這限制了對冠突散囊菌的全面了解﹒參考鄭欣欣[8]和呂嘉櫪等[9]的研究結果可知，高滲培養基和高溫環境等可促使冠突散囊菌生殖方式由有性型向無性型轉變﹒但對于冠突散囊菌無性孢子的具體產孢條件及其發酵工藝優化方面的研究則尚未見于報道，這不利于對冠突散囊菌這一重要微生物資源的進一步認識與利用﹒鑒于此，本文通過探索不同培養條件下誘導冠突散囊菌分生孢子的最佳產孢工藝，以期為研究冠突散囊菌兩性發育和產孢機制等提供試驗基礎﹒

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

冠突散囊菌(JH1205)由黑茶金花湖南省重點實驗室提供﹒

1.1.2 培養基

菌種活化與培養采用改良PDA 培養基，制備方法如下：200 g 馬鈴薯切片，加水煮沸后持續30min，過濾去除馬鈴薯渣，添加100 g 蔗糖、5 g NaCl 和20 g 瓊脂粉并攪拌溶解，補充蒸餾水定容至1 000m L﹒

1.2 儀器設備與試劑

YP802N 型電子分析天平(上海精科儀器設備公司)；VD-650單人型超凈工作臺(迎工機械有限公司)；DHP-9810型生化培養箱(上海一恒儀器有限公司)；JSM-6380LV 型掃描電子顯微鏡(日本日立電子株式會社)；CFIS60型倒置顯微鏡(江南永新儀器有限公司)；HY-4A 型振蕩器(湖南力辰儀器科技有限公司)；XFH-70C型自動蒸汽滅菌鍋(浙江新豐儀器有限公司)﹒試驗所用NaCl、瓊脂粉和蔗糖等試劑均為國產化學純﹒

1.3 試驗方法

1.3.1 冠突散囊菌孢子懸液的制備

取菌落長勢良好的PDA 平板，注入無菌水并用菌種刮鏟刮取菌落上的孢子，將菌液適度稀釋并振搖均勻后，獲得冠突散囊菌孢子懸液(經血球計數板法檢測孢子數量為106個/mL)，以此作為接種液﹒

1.3.2 不同濃度蔗糖誘導培養試驗

制備PDL 液體培養基：每1 000 mL 培養基使用300 g 馬鈴薯，設置NaCl含量為10%，分裝后添加不同質量的蔗糖，分別配制出蔗糖含量為5%，10%，15%，20%，25%和30%的6組PDL培養液；高壓蒸汽滅菌后，在超凈工作臺上將培養液按每瓶100mL 分裝至400mL 植物組織培養瓶，每個蔗糖濃度梯度設置3組平行；最后用移液槍接種1 mL 冠突散囊菌孢子懸液，輕微搖勻后置于28℃恒溫箱靜置培養﹒

1.3.3 不同濃度NaCl 誘導培養試驗

液體培養基的制備同1.3.2，設置NaCl梯度為4%，6%，8%，10%，12%和14%，每組樣品設置3個平行，按1.3.2 的方法接種孢子懸液并置于28℃環境培養﹒

1.3.4 不同溫度誘導培養試驗

液體培養基的制備同1.3.2，設置蔗糖濃度為10%、NaCl濃度為10%，按1.3.2 的方法接種孢子懸液，分別置于28，30，32，34，36和38℃的恒溫培養箱中靜置培養，每個試驗組設置3個平行﹒

1.3.5 冠突散囊菌兩性孢子的觀察與區分

挑取生長狀況適宜的菌體制成固定標本，采用離子濺射儀對樣品表層進行噴金處理后[10]，在掃描電鏡下觀察其有性形態及無性形態；配合電鏡觀察的結果，在倒置顯微鏡下觀察并進一步確認兩性形態的結構差異；綜合菌落表面形態、倒置顯微鏡及電子顯微鏡觀察的結果，確認冠突散囊菌無性生殖形態的特征﹒

1.3.6 冠突散囊菌分生孢子的計數

挑取一瓶培養瓶內的全部菌體，置于100m L搖瓶內，加入少量無菌生理鹽水和玻璃珠，置于振蕩器上300 r/min 振搖打散菌體；過200 目篩以獲得含有孢子的濾液，用無菌生理鹽水重復洗滌、過濾6次以充分洗脫附著在菌體上的孢子；合并孢子濾液定容至1 000m L并再次混勻，采用血球計數板法[11]在倒置顯微鏡下統計冠突散囊菌分生孢子的數量，計算出每毫升培養液通過發酵后獲取的冠突散囊菌分生孢子數量(個/mL)﹒

1.3.7 冠突散囊菌產分生孢子的正交優化試驗

依據1.3.2 ～1.3.4 單因素試驗的結果，確定不同的蔗糖濃度、NaCl濃度和發酵溫度3個因素的具體參數，設計3因素3水平的正交試驗進一步優化冠突散囊菌液態發酵產分生孢子的工藝，每組發酵條件設置3組平行，結果取平均值，試驗因素及水平設計如表1所示﹒

表1 正交試驗的因素與水平

獲取最佳條件工藝后，在此培養條件下開展驗證試驗，接種及培養方法同1.3.2，平行培養5組，通過相對標準偏差評估試驗結果的精密度﹒1.3.8 菌株JH1205產分生孢子的培養時間優化

根據1.3.7 正交試驗優化的結果進行液體培養，并于培養的第4，5，6和7 d 觀察并檢測培養液中分生孢子含量，確定優化發酵工藝下冠突散囊菌分生孢子最佳產孢時間﹒

2 結果與分析

2.1 冠突散囊菌的兩性型形態差異

冠突散囊菌的兩性型差異如圖1所示﹒

圖1 冠突散囊菌的兩性型差異

由圖1不難發現，其有性型與無性型的差異較為顯著：有性型菌膜呈現金黃色，菌膜表面粗糙而致密，菌膜中央部位偶爾可見黑褐色香油狀滲出液，隨生長時間的延長，菌膜顏色逐漸變深成為棕黃色，且滲出液增多，到后期則完全轉變為黑褐色；無性型菌膜緊致而細密，表面相對有性型較為光滑，無滲出液，菌膜色澤呈較均勻的灰綠色，和有性型區分度較高(見圖1A)﹒在電鏡觀察下，未成熟的閉囊殼為橢球狀(見圖1B)，外表纏繞有大量營養菌絲，直徑100～150μm；子囊孢子表面粗糙具尖疣(見圖1C)，赤道部位具有顯著的冠狀突起，大小4～5μm×5～6μm；光鏡觀察下，子囊孢子與電鏡形態基本一致，可通過其雙凸鏡的造型與分生孢子區分開來(見圖1D)﹒電鏡觀察下，分生孢子頭由菌絲特異化形成，形似掃帚狀，孢子梗上串生有大量分生孢子(見圖1E)，隨時間延長而逐漸增大；成熟的分生孢子從孢梗莖上脫落(見圖1F)，孢子呈橢球狀，外壁布滿小點狀突起，直徑4～5μm，其形狀相對子囊孢子較為規則﹒冠突散囊菌兩性型的形態差異與譚玉梅等[12]的研究結果基本一致，電鏡下偶爾可觀察到有性型和無性型分布在一個視野內(見圖1H)，可通過表觀形態和顯微特征等將其有性型與無性型有效區分開來﹒

2.2 不同濃度蔗糖對冠突散囊菌分生孢子產量的影響

當發酵液NaCl 含量為10%、培養溫度28℃和培養時間5 d 時，不同濃度蔗糖對冠突散囊菌分生孢子的生長影響如圖2所示﹒

圖2 不同濃度蔗糖對冠突散囊菌分生孢子產量的影響

在圖2中，當蔗糖含量在5%～15%之間時，隨蔗糖濃度的上升，分生孢子產量也隨之快速提高；當蔗糖含量在15%～25%之間時，孢子產量仍然與蔗糖濃度正相關，但提升速度開始減緩；當蔗糖含量為25%時，孢子產率達到最高值4.13×107個/mL，比蔗糖含量5%時提高了接近3倍﹒這說明，蔗糖作為冠突散囊菌適宜利用的碳源[9]，一方面可以促進發酵液中的菌體生長，有效提高總生物量；另一方面，高濃度蔗糖使得培養液滲透壓上升，也可以促使其繁殖方式由有性型向無性型轉變，提高分生孢子的產率﹒但蔗糖含量進一步提高至30%時，孢子產率反而有所下降，有可能是蔗糖導致培養液滲透壓過高，反過來抑制了菌體的生長；亦有可能是過高濃度的蔗糖使培養液變得粘稠，導致底物流動性下降，不利于菌體的發育﹒因此，單因素試驗最適宜的蔗糖添加量選定為25%﹒

2.3 不同濃度NaCl對冠突散囊菌分生孢子產量的影響

當發酵液蔗糖含量為10%，培養溫度為28℃，培養時間為5 d 時，不同濃度NaCl對冠突散囊菌分生孢子的生長影響如圖3所示﹒

圖3 不同濃度NaCl 對冠突散囊菌分生孢子產量的影響

由圖3可知，在NaCl 濃度較低(＜8%)時，冠突散囊菌繁殖方式以有性的子囊孢子為主，隨著NaCl 濃度的增加，發酵液中灰綠色分生孢子的比例逐漸增加；當發酵液NaCl 濃度≥8%后，無性繁殖則開始占據主導，尤其是在NaCl 濃度≥10%的發酵液中，基本未見金黃色閉囊殼結構﹒NaCl濃度為10%時分生孢子產量達到最高值2.28×107個/mL，說明適當濃度的NaCl 可以通過改變細胞膜內外滲透壓和影響代謝方式來改變菌株的生殖模式[13]﹒而當NaCl 的濃度再進一步提升時，分生孢子產量顯著下降，由發酵液中較低的菌體生物量可以推測，高濃度的NaCl 對冠突散囊菌營養菌絲的生長有一定抑制作用，從而導致了產孢量的減少﹒

2.4 不同發酵溫度對冠突散囊菌分生孢子產量的影響

當發酵液NaCl含量為10%、蔗糖含量10%和培養時間5 d 時，不同培養溫度對冠突散囊菌分生孢子的生長影響如圖4所示﹒

圖4 不同發酵溫度對冠突散囊菌分生孢子產量的影響

由圖4可知，當培養溫度處于28～34℃時，隨著溫度的升高，冠突散囊菌分生孢子的產量隨之上升，在34℃時孢子產量達到最大值3.08×107個/mL﹒這說明在同樣的培養基條件下，不同的生長溫度會影響冠突散囊菌基因的表達，使得其繁殖模式發生轉變，從而大量產生抗逆性較強的分生孢子，這一點和其它真菌在不同環境條件下的兩性繁殖模式是類似的[14]﹒當溫度高于34℃時，隨著溫度的升高，分生孢子的產量卻開始下降，其主要原因可能是冠突散囊菌作為一種真菌，其菌絲最適宜的生長溫度為28℃左右[15]，故對高溫的耐受能力相對較差，而在菌絲生物量較低的情況下，會影響分生孢子的產生﹒

2.5 冠突散囊菌產分生孢子的正交優化試驗

在單因素試驗的基礎上，開展不同的蔗糖濃度、NaCl 濃度和發酵溫度的3因素3水平正交試驗，結果如表2所示﹒

表2 不同培養條件的正交試驗結果

由表2可知，不同因素對分生孢子產率的影響的大小依次為：NaCl濃度＞發酵溫度＞糖濃度，優化后的最佳產孢條件為A1B2C2，即蔗糖含量20%、NaCl含量10%和培養溫度34℃，此條件下培養獲得的孢子產量為6.91×107個/mL﹒

2.6 優化產孢條件驗證試驗

制作蔗糖含量為20%、NaCl 含量為10%的PDL 液體培養基，按1.3.2 中的方法分裝滅菌與接種，并置于34℃環境下培養5 d﹒結果顯示：5組平行培養液分生孢子產量分別為6.40，6.51，6.63，6.99和7.54(×107個/mL)，可見孢子產量在(6.40～7.54)×107個/mL之間波動，平均產量為6.81×107個/mL，相對標準偏差RSD為0.067 9，表明該優化培養條件可重復性較好，能在液態發酵中有效提升冠突散囊菌分生孢子的產量﹒

2.7 不同培養時間對冠突散囊菌分生孢子產量的影響

采用正交試驗法得到的優化工藝進行培養，并于培養的第4，5，6和7 d 觀察并檢測培養液中分生孢子含量，結果如圖5～圖6所示﹒

圖5 不同培養時間對冠突散囊菌分生孢子產量的影響

圖6 不同培養時間對冠突散囊菌菌膜表面的影響

由圖5可知，當第4～5 d 時，分生孢子產量隨時間延長提升較快，其間24 h 的發酵使分生孢子濃度提高了2.18×107個/mL，此時菌膜均呈現無性型為主的灰綠色(見圖6A 和圖6B)；當培養時間超過5 d 時，進一步提升發酵時間對分生孢子的產量影響較小﹒觀察發酵液可知，從培養的第6 d 起，菌膜表面開始少量生長子囊孢子(見圖6C)；到第7 d 時，菌膜則開始大量附著子囊孢子導致其色澤由先前的灰綠色轉化為金黃色(見圖6D)﹒由此表明，冠突散囊菌以有性型作為其繁殖的主要模式，即使在適宜培育無性型的環境條件下，仍會隨著培養時間的延長而逐漸轉化至有性型﹒根據葛永怡等[16]的研究可知，和冠突散囊菌產孢相關的MAT 1-1-1 基因在不同生長階段的差異性表達，可能是造成這一現象的主要原因﹒鑒于子囊孢子的產生會對無性型的觀察與研究造成一定影響，因此本文最終選擇5 d 為產分生孢子的最佳發酵時間﹒

3 討論與結論

通過單因素試驗及正交試驗，探尋不同的蔗糖濃度、NaCl 濃度、培養溫度和發酵時間對冠突散囊菌分生孢子的產孢影響﹒結果表明：PDL 液體培養基添加20%蔗糖和10%NaCl，以及培養溫度34℃和培養時間5 d 是分生孢子的最佳發酵工藝條件，且孢子產量平均值達到6.81×107個/mL﹒此發酵工藝可快速制備冠突散囊菌分生孢子，用以作為菌種代謝特性和分子信息等研究的材料﹒對比鄭欣欣[8]的研究可知，本文所提冠突散囊菌分生孢子產孢工藝與子囊孢子產孢工藝之間有著顯著差異，即不僅需要較高滲透壓和溫度，且其產孢周期也相對較快﹒由Ge等[17]對冠突散囊菌兩性型基因轉錄組測序的分析結果可知，外界因素可調控冠突散囊菌生殖基因的表達，能決定真菌最終的繁殖模式﹒總而言之，誘導冠突散囊菌產生分生孢子的關鍵因素為滲透壓脅迫和一定程度的高溫﹒雖然添加NaCl 和蔗糖都能有效提高培養液滲透壓，但NaCl對分生孢子產生的影響顯著大于蔗糖，可能是Na+能更大限度地改變冠突散囊菌細胞膜的通透性，促使膜內外物質的交換，因此誘導產孢效果較好；而蔗糖主要是作為碳源來影響冠突散囊菌的菌絲生長，其通過調節生物量的方式影響產孢效果﹒本研究結果明確了冠突散囊菌分生孢子產孢工藝，為進一步了解和發掘這一微生物資源提供了基礎﹒