兩種重金屬聯合脅迫下斑馬魚的規避行為變化

李秀麟，趙志偉，李星權，畢鑫琪，梁志杰，劉國臣

(1. 中國人民解放軍陸軍勤務學院軍事設施系，重慶 401331；2. 重慶大學環境與生態學院，三峽庫區生態環境教育部重點試驗室，重慶 400044)

近年來，水環境污染問題日益嚴峻，水污染事故頻發引起了國內外對水質安全的高度重視[1]。其中，重金屬是目前水體中最常見的污染物之一，具有危害高、治理難等特點[2]。因此，如何快速、準確監測水體重金屬污染并對其進行科學評價，成為當今環境科學關心的熱點問題。相較于以往的理化分析手段，生物毒性分析具有方便簡易、靈敏度高和監測時間短等優點，能夠快速準確地監測和預警水質突發性污染。

生物監測與預警系統以水生生物對污染物的生理行為響應為基礎，通過實時連續監測受試生物行為反映水質變化[3]。目前，魚類生物常常被用于水質污染物的監測，其試驗結果大多數情況也適用于人類。生物及其生存環境是統一整體，當外界環境發生變化時，生物適應性的表現方式首先為行為改變，而其行為變化的程度及對污染水體的不同反應為水質污染監測提供了基本數據支撐。通常情況下，水體環境常常受到多種污染物聯合作用，水生生物與水體中的污染物直接接觸[4]，其行為數據的變化表征為多種化合物的聯合毒性。

目前，魚類生物監測與預警系統主要有深圳RTB、德國BBE、中國科學院的BEWs，均是通過高清攝像頭對魚類的游動行為進行捕捉，通過軌跡分析軟件對其運動行為指標(游動速度、加速度等)與群體行為指標(分散度、平均距離等)進行量化分析，其結果受外界非毒性因素(噪聲、光照)影響較大，且耗時較長。魚類的規避行為是魚類的自發性行為反應，當受到污染物刺激后，會自動前往無污染或污染程度較低的區域，其受外界因素影響較低。

本研究以2種重金屬(Zn2+、Cd2+)聯合脅迫下斑馬魚的規避行為變化為基礎，考察2種重金屬聯合脅迫下對斑馬魚游動速度與距中心對角線距離的影響，研究在水質突發性污染情況下多種污染物的聯合毒性對水生生物的行為響應變化，為水質監測預警模型的建立提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

(1)試驗生物：斑馬魚，購于沙坪壩花鳥魚市場，分批次購買，每批次的斑馬魚數量需滿足3組試驗的試驗用量，健壯無病，體型一致，無畸形；斑馬魚體長為(4±1)cm，在實驗室中飼養7 d，當死亡率低于5%時，方可用于試驗[5]；定期更換飼養箱中的水，通過持續曝氣，保證飼養箱中水體的含氧量≥6 mg/L；每天對魚類進行投食，并清理飼養箱中的糞便和殘存的餌料，試驗前24 h停止喂食；光照周期為10 h∶14 h。

(2)化學試劑：氯化鋅(ZnCl2、分析純、阿拉丁)，氯化鎘(CdCl2、分析純、阿拉丁)。

(3)試驗儀器：魚類規避行為預警裝置，若達思(EthoVision XT)操作系統，溶解氧測定儀，80 L水箱(2個)，燒杯(2 L)、玻璃棒、容量瓶等玻璃器皿，分析天平，溫度控制裝置。

1.2 試驗設計

采用60 min流水暴露試驗，測定斑馬魚在不同毒性濃度氯化鎘、氯化鋅中的行為毒性響應。在流水試驗中，污染物的配置濃度以24 h的半致死劑量為一個毒性單位，即1 TU。試驗分別在不同污染物濃度(毒性單位)不同比例(10∶0、3∶7、5∶5、7∶3、0∶10)下進行，其中，氯化鎘、氯化鋅的LC50-24 h分別為 6.69、40.8 mg/L[6]。

在聯合污染物的暴露試驗中，試驗用水使用充分曝氣的自來水。試驗分別記錄在0.1、0.5、1、2 TU濃度下斑馬魚的游動行為變化，記錄每分鐘的平均值，試驗條件與實驗室斑馬魚培養條件一致，試驗過程中不予投加食物。該試驗進行時長為1 h，前30 min為無污染物暴露下的空白試驗，后30 min為污染物暴露下的對照試驗(因無法避免個體差異，如果選用不同的斑馬魚做對照試驗，將影響試驗的準確性)。

毒性試驗采用持續曝氣的自來水配液，且所設置的毒性濃度指配置時的濃度，而非進入監測裝置中的1個變化濃度。該暴露試驗是一個60 min的流水暴露試驗，每組試驗8條斑馬魚，流量設置為15 L/h，避免對斑馬魚的游動造成較大沖擊。水溫通過溫度控制裝置調節為(26±1)℃，背景光照恒定不變，為實驗室燈光。同時，試驗過程中盡量控制，減少人為、噪音等客觀因素的影響。若達思軟件通過攝像頭以10～12幀/s保存監測圖片，為能夠更方便地展示魚類行為的變化，監測結果以8條魚每分鐘的平均值為有效值，總計60個有效值。各數值的表現方式為平均數±標準誤差(mean±SEM)。

試驗過程中，為了明確斑馬魚規避行為的變化，采用距中心對角線距離與游動速度來反映其行為變化，試驗裝置設計圖及實物如圖1、圖2所示，距中心對角線距離分析如圖3所示。由于攝像頭的視角以及區域劃分中存在不可避免的誤差，認為當中心管距離在20 cm以上時，魚類已進入脅迫逃離區。在此過程中，游動速度出現變化的時間(T1)的判斷標準：變化前5 min的平均值與變化后5 min的平均值的相對差值在20 %以上[7]；距中心對角線距離出現變化的時間(T2)的判斷標準：變化后每分鐘的距離平均值在15 cm以下的占比在20%以下。

圖1 裝置設計圖Fig.1 Design Drawing of the Device

圖2 裝置實物圖Fig.2 Physical Map of the Device

圖3 距中心對角線距離分析圖Fig.3 Analysis Chart of Diagonal Distance from the Center

2 結果與分析

氯化鋅與氯化鎘聯合作用下，斑馬魚的游動速度與距中心對角線的距離變化如圖4～圖8所示。在對照組中，其游動速度與距中心對角線的距離波動不大，游動速度相對穩定，距中心對角線距離基本穩定在10～15 cm。在試驗組中，游動速度呈現先上升后下降的趨勢，距中心對角線距離呈現逐漸增大而后穩定的趨勢，最終穩定在21 cm左右，可視為基本進入脅迫逃離區。

2.1 聯合暴露下游動速度的變化分析

在0.1、0.5、1、2 TU的濃度暴露下，其游動速度出現變化的時間(T1)如表1所示，基本穩定在(12±1.0)、(8.4±1.1)、(4.6±0.89)、(1.6±0.54)min。斑馬魚在接觸污染物后，其游動速度均呈現先上升后下降的趨勢，試驗組與對照組的游動速度比值如表2所示。相同比例條件下，在0.1～2 TU的濃度暴露下，游動速度比值呈現先增大后降低的趨勢；在0.1～1 TU的濃度暴露下，游動速度最終穩定在對照組平均水平。斑馬魚逐漸調整行為機制，適應污染環境，通過調節機體的代謝和生理機能而逐步適應，使魚體達到一個新的平衡狀態[8]。在2 TU暴露下，游動速度在對照組平均水平停留短暫時間后繼續下降，可能是因為在高濃度毒性暴露下，斑馬魚的行為機制受損，無法適應高濃度暴露環境，只能通過降低其行為活動和新陳代謝來減少與污染物的接觸[9]。

表1 游動速度變化時間Tab.1 Time Change of Swimming Speed

通過SPSS20.0軟件對試驗組與對照組的30個游動速度數據進行差異性分析，如表3所示。結果表明：在0.1～1 TU的濃度暴露下，試驗組與對照組的差異顯著性隨濃度的升高而增大；在0.1 TU暴露下，對照組與試驗組呈現顯著性差異(p<0.05)，其中，Zn2+∶Cd2+=3∶7時達到極顯著性差異(p<0.01)；在1 TU和2 TU暴露下，對照組與試驗組則已呈現十分顯著的差異(p<0.001)。

表2 Zn2+與Cd2+聯合作用下試驗組與對照組行為 指標比值Tab.2 Comparison of Behavior Indicators Ratio between Experimental Group and Control Group under the combination of Zinc Ion and Cadmium Ion

表3 污染物暴露下對照組與試驗組的行為指標差異性分析Tab.3 Differences Analysis in Behavioral Indexes of Control and Experimental Groups under Pollutant Exposure

注：(a)0.1 TU毒性濃度；(b)0.5 TU毒性濃度；(c)1 TU毒性濃度；(d)2 TU毒性濃度圖4 Zn2+∶Cd2+=10∶0下斑馬魚行為的變化Fig.4 Behavior Changes of Zebrafish under Zn2+∶Cd2+ of 10∶0

注：(a)0.1 TU毒性濃度；(b)0.5 TU毒性濃度；(c)1 TU毒性濃度；(d)2 TU毒性濃度圖5 Zn2+∶Cd2+=7∶3下斑馬魚行為的變化Fig.5 Behavior Changes of Zebrafish under Zn2+∶Cd2+ of 7∶3

注：(a)0.1 TU毒性濃度；(b)0.5 TU毒性濃度；(c)1 TU毒性濃度；(d)2 TU毒性濃度圖6 Zn2+∶Cd2+=5∶5下斑馬魚行為變化示意圖Fig.6 Behavior Changes of Zebrafish under Zn2+∶Cd2+ of 5∶5

注：(a)0.1 TU毒性濃度；(b)0.5 TU毒性濃度；(c)1 TU毒性濃度；(d)2 TU毒性濃度圖7 Zn2+∶Cd2+=3∶7下斑馬魚行為變化示意圖Fig.7 Behavior Changes of Zebrafish under Zn2+∶Cd2+ of 3∶7

注：(a)0.1 TU毒性濃度；(b)0.5 TU毒性濃度；(c)1 TU毒性濃度；(d)2 TU毒性濃度圖8 Zn2+∶Cd2+=0∶10下斑馬魚行為變化示意圖Fig.8 Behavior Changes of Zebrafish under Zn2+∶Cd2+ of 0∶10

在相同毒性濃度不同比例下，對照組與試驗組的游動速度比值也存在著差異。由表2可知，在0.1～1 TU暴露、兩種重金屬聯合作用條件下，其游動速度的比值明顯高于單一重金屬作用，其中，當Zn2+∶Cd2+=3∶7時，比值分別為0.20、0.27、0.33，明顯高于同一毒性濃度下其他比例；在2 TU暴露下，游動速度的比值低于單一重金屬作用，其中，當Zn2+∶Cd2+=3∶7時，比值為0.14，明顯低于同一濃度下其他比例比值。結果表明，鋅、鎘離子的聯合毒性作用對斑馬魚的刺激大于單一重金屬作用，其中，當Zn2+∶Cd2+=3∶7時，其對斑馬魚的毒性作用大于其他比例。

注：(a)10∶0；(b)7∶3；(c)5∶5；(d)3∶7；(e)0∶10圖9 距中心對角線距離變化率與濃度回歸分析Fig.9 Regression Analysis of Change Rates of the Distance from the Center Diagonal and the Concentration

2.2 聯合暴露下距中心對角線距離的變化分析

在0.1、0.5、1、2 TU的濃度暴露下，距中心對角線距離出現變化的時間(T2)如表4所示，基本穩定在(13.8±0.84)、(11±0.71)、(6.8±0.84)、(3±0.71)min。斑馬魚在接觸污染物后，距中心對角線距離逐漸增大，表明斑馬魚逐漸遠離中心污染物擴散管，開始向低毒性濃度的區域靠近；隨著暴露時間的延長，斑馬魚距中心污染物擴散管的距離越大，最后全部進入脅迫逃離區，穩定在20～24 cm，表明魚群完全進入避險逃離區。隨著暴露濃度的上升，斑馬魚進入脅迫逃離區的時間越短。黃毅等[10]的研究表明，魚群在感知到污染物存在后，會自動逃離至污染程度較低或無污染的區域。在魚類的回避階段，魚的機體本身并未受到損傷，而僅僅是一種“有目的性逃跑”行為，這一過程可持續幾秒到幾個小時[11]，回避反應是多數水生生物體應對水環境污染刺激的第一反應。

表4 距中心對角線距離變化時間Tab.4 Change Time of Diagonal Distance from the Center

通過SPSS20.0軟件對試驗組與對照組的30個距中心對角線距離數據進行差異性分析，如表3所示。結果表明：在0.1～1 TU的濃度暴露下，試驗組與對照組的差異顯著性隨毒性濃度的升高而增大；其中，在0.1、0.5 TU的濃度暴露下，當Zn2+∶Cd2+=3∶7時，其差異顯著性要高于同毒性濃度下的其他比例；在1、2 TU的濃度暴露下，對照組與試驗組則已呈現十分顯著的差異(p<0.001)。

在相同濃度不同比例下，對照組與試驗組的比值也存在極大的差異，其結果分析與游動速度基本一致。鋅、鎘離子聯合作用下對斑馬魚規避行為的刺激大于單一重金屬作用。其中，當Zn2+∶Cd2+=3∶7時，其規避行為效應要大于其他比例。對距中心對角線距離的比值與濃度進行回歸性分析，結果如圖9所示，回歸性方程如表5所示。在不同比例下，相關性系數均大于0.9，表現為正相關，表明距中心對角線距離與濃度呈現良好的劑量-效應關系。其中，聯合污染物暴露下，其規避行為趨勢較單一重金屬暴露下更加明顯，表明重金屬聯合作用對斑馬魚的刺激要高于單一重金屬作用，其中，當Zn2+∶Cd2+=3∶7時，刺激作用最強。

表5 回歸性分析統計Tab.5 Statistics of Regression Analysis

3 結論

(1)在兩種重金屬聯合脅迫下斑馬魚的行為變化試驗中，由斑馬魚游動速度的變化可知：低濃度毒性作用下，斑馬魚經歷行為刺激、行為調整、行為適應；高濃度毒性作用下，斑馬魚除了經歷這3種作用，還會經歷行為強度降低。

(2)在兩種重金屬聯合脅迫下斑馬魚的行為變化試驗中，隨著與污染物接觸時間的延長，斑馬魚逐漸遠離中心污染物擴散管，最后基本完全進入脅迫逃離區。斑馬魚逃離中心污染物擴散管的行為趨勢強度與濃度呈正相關，濃度越高，其逃離趨勢越明顯，進入脅迫逃離區的時間越短。結果表明，斑馬魚在接觸污染物后，會自動逃離至污染物或污染程度較低的區域，且濃度越高，逃離趨勢越明顯，該行為驗證了規避行為試驗裝置設計的可靠性。

(3)相同毒性濃度不同比例暴露，在鋅離子與鎘離子聯合暴露下，對斑馬魚的刺激作用要強于單一重金屬暴露。對試驗組與對照組距中心對角線距離的比值進行回歸性分析，表明重金屬聯合作用下規避趨勢較單一污染物作用更加明顯，鋅、鎘離子聯合作用表現為毒性增大的協同作用。當24 h半致死濃度較高的污染物占據主導地位時，其聯合毒性作用更強。