基于CAR T免疫治療方法用PHA包裹pomalidomide構筑醫用紡織品功能后整理劑

王志雄，劉 慧，繆偉偉，傅珈豫，娜日蘇2，

（1.上海理工大學，上海 200093；2.馬鞍山學院，安徽馬鞍山 243100；3.日本國立大阪大學，日本大阪府吹田市 565-0871）

跨界研究和醫工融合，用工學的手段解決醫學問題已越來越多地受到研究者的關注與追捧。本研究主要是通過設計紡織品后整理劑賦予紡織品特殊的醫學功能，并利用藥學原理達到提高醫學治療效果的目的。隨著醫療手段和紡織品后整理技術的不斷進步，醫用紡織品在醫療行業中的應用越來越廣，包括普通醫用紡織品和高性能醫用紡織品。高性能醫用紡織品是指采用高科技提高產品使用性能、增加產品附加值，達到醫用目的的紡織品，如外科用非植入性紡織品［1］。而這些醫用紡織品很大一部分功能是依靠后整理劑來實現的。

經皮給藥系統（transdermal drug delivery system，TDDS）是指藥物以恒定速度（或接近恒定速度）穿過角質層，通過皮膚吸收進入全身血液循環，達到有效血藥濃度，高效率地轉送到目標組織，實現疾病的治療或預防［2］。為了降低皮膚天然屏障對藥物吸收的阻礙作用，目前主要采用物理方法、生物化學方法促進藥物透皮吸收。其中物理方法主要包括離子導入、電穿孔、超聲波導入和微針等，在緊急或病情嚴重的情況下，該方法能夠顯著提高藥物滲透率，提高臨床療效。但對長期用藥的患者來說，他們皮膚的天然結構會被破壞，導致部分皮膚病的發生。

聚羥基脂肪酸酯（PHA）是一種由羥基脂肪酸單體構成的高分子聚合物，由6～14 個單體碳原子組成的mcl-PHA 玻璃化溫度（Tg）低，在常溫下有黏著性［3］。由分子結構可知，PHA 主鏈具有弱親水性，側鏈具有疏水性，因此對離子型物質具有良好的分散作用［4］。前期的研究表明，mcl-PHA 能夠控制藥物釋放，并在較長時間內維持特定的物質濃度［5］；mcl-PHA 是高分子材料，不容易進入人體且可生物降解，不會對環境造成污染。因此，以mcl-PHA 作為基質制備含有pomalidomide的醫用紡織品功能后整理劑構筑pomalidomide TDDS 是可行的。選用TDDS 的優點：（1）避開了肝臟對藥物的首過效應；（2）血藥濃度容易維持穩定；（3）撤藥方便簡單。

FDA 批準了第一種CAR T 細胞療法，用于治療CD19 抗原陽性的復發性或難治性B 細胞急性淋巴細胞白血?。ˋLL）［6］，但CAR T 細胞療法成功治療實體瘤的報道很少。而pomalidomide（CC-4047，Actimid；Celgene Corporation，Warren，NJ，USA）是第三代免疫調節藥物，不僅可以調節T 細胞功能，還能改善腫瘤微環境［7-8］。但關于pomalidomide 與CAR T 細胞聯合治療實體瘤的報道還很少。本研究以第三代CAR T細胞CD133-CAR T 細胞［9］作為研究對象，并以U251 CD133-OE luc（轉入螢火蟲熒光素酶基因且CD133過表達的人膠質瘤細胞）作為靶細胞，探究了pomalidomide 對CD133-CAR T 細胞的調節作用，以及將mcl-PHA 用于醫用紡織品構筑的pomalidomide 經皮給藥系統的透皮能力。

1 實驗

1.1 材料

mcl-PHA（大阪大學藥學研究科生物工學研究室），凍存的人外周血單核細胞（PBMC）［ALLCELLS（PB005F，Alameda，CA，USA）］，pomalidomide（HY-10984，Monmouth Junction，NJ，USA）（MedChemExpress），膠質瘤細胞系U251（U251-WT）（中國科學院細胞庫）。

1.2 細胞制備

用編碼人CD133 蛋白的piggyBac 轉座子質粒和piggyBac 轉座酶載體對U251 細胞進行核轉染，通過藥篩得到過表達CD133 的細胞U251 CD133-OE。再用編碼螢火蟲熒光素酶的轉座子質粒和piggyBac 轉座酶載體再次對U251 CD133-OE 進行核轉染，并且通過藥篩獲得表達熒光素酶的腫瘤細胞株U251 CD133-OE luc。使用編碼螢火蟲熒光素酶的轉座子質粒和piggyBac 轉座酶載體對U251 細胞進行核轉染，得到U251-WT luc［10］。將表達CD133-CAR 的piggyBac 轉座子質粒和piggyBac 轉座酶載體轉入PBMC內，經激活培養和藥篩得到CD133-CAR T 細胞［9］。對照細胞為未轉染的T（NT）細胞，制備方法與CAR T 細胞類似，但是省去電轉和藥篩等步驟。pomalidomide的濃度為10 mmol/L，在-80 ℃下儲存，溶于二甲基亞砜（DMSO）。

1.3 測試

1.3.1 體外透皮

在室溫條件下，取10 mg mcl-PHA（溶解于氯仿中）與5 mg 模型藥物混合，均勻涂覆于聚酯薄片表面，干燥后制成TDDS 模型。在玻璃圓筒上貼上響尾蛇蛻下來的新鮮蛇皮，干燥后向玻璃圓筒里注入生理鹽水，放置一段時間后棄去生理鹽水。將制備好的TDDS 模型貼在蛇皮上，再向玻璃筒內部注入生理鹽水，構筑體外滲透研究裝置（如圖1 所示）。滲透24 h后用UV-2450 分光光度計測量生理鹽水中模型放出藥物的濃度，分析mcl-PHA 促進藥物滲透的效果，實驗至少重復3次。

圖1 體外滲透裝置

1.3.2 細胞毒性

將U251 CD133-OE luc 或U251-WT luc 腫瘤 細胞按照1×104個/孔接種到96 孔白色微孔板（PerkinElmer，Waltham，MA，USA）中，根據不同的效靶比加入CD133-CAR T 細胞，同時加入pomalidomide（藥物最終濃度分別為0.1、1.0、10.0 μmol/L），共培養200 μL。細胞在T 細胞培養基中培養72 h 后加入0.75 mg/mL D-熒光素K+鹽（PerkinElmer，122799），并使用En-Spire Multimode 讀板儀（PerkinElmer）讀取信號值，實驗至少重復3 次。靶細胞殺傷效率p=（1-共培養孔的熒光值/腫瘤細胞單獨培養孔的熒光值）×100%，用GraphPad Prism 軟 件6.0 版（GraphPad Software，San Diego，CA，USA）對計算結果進行統計學處理，p小于5%即認為具有統計學意義。

1.3.3 細胞因子分泌水平

在96孔板中接種1×105個U251 CD133-OE luc腫瘤細胞，并按照2∶1 的效靶比加入CD133-CAR T 細胞，再加入pomalidomide使最終濃度為1 μmol/L，共培養200 μL，培養24 h。收集上清液，按AlphaLISA 試劑盒（PerkinElmer；IL-2，AL221C；IFN-γ，AL217C；TNFα，AL208C；GM-CSF，AL216C）的使用說明檢測細胞因子濃度。NT 細胞的細胞因子檢測需要將2×105個NT 細胞接種至96 孔板，并按照使用說明加入T Cell TransAct?human（Miltenyi Biotec GmbH，Cologne，NRW，Germany）激活劑，培養24 h，收集上清液并檢測。每種細胞因子的濃度以3 個復孔計算的均值來表示，實驗至少重復3 次，細胞因子濃度均值的計算使用Excel 完成，實驗結果使用FlowJo V-10（BD Biosciences，Bedford，MA，USA）進行處理。

2 結果與討論

2.1 體外透皮結果

觀察mcl-PHA 構筑的經皮給藥系統，在干燥前能均勻混合，呈透明狀，沒有發生結晶現象；放置一段時間后在空氣中未發生反應，性能穩定，即mcl-PHA 構筑的經皮給藥系統具有良好的穩定性。模型藥物的實驗劑量為273.24 μg/d，TDDS 在1×10 cm2面積上需要的滲透量為27.324 μg/cm2/d。由表1 可知，在mcl-PHA 基質中藥物的透皮滲透量平均值為27.867 μg/cm2/d，方差為0.450 925，說明mcl-PHA 構筑的TDDS使藥物濃度滿足實驗需要。

表1 藥物的透皮滲透量

2.2 pomalidomide 增強CD133-CAR T細胞功能

由圖2 可知，在藥物濃度相同的情況下，CD133-CAR T 細胞的殺傷效率隨著效靶比的提高而不斷升高。當效靶比為2∶1時，3種濃度的加藥組殺傷效率都有明顯提高；當效靶比為1∶1或1∶2時，只有當pomalidomide 濃度為0.1 或1.0 μmol/L 時，pomalidomide 組的殺傷效率相比DMSO 組才有明顯提高。當效靶比一定時，1.0 μmol/L pomalidomide 對CD133-CAR T 細胞的殺傷功能促進作用最強。同時，采用U251-WT luc（CD133 抗原低表達的膠質瘤細胞）作為靶細胞與CD133-CAR T細胞共培養后，pomalidomide對CD133-CAR T 細胞的殺傷功能沒有影響。這說明在CD133-CAR T 細胞未被激活的情況下，pomalidomide 不會誘導CD133-CAR T 細胞產生非特異殺傷作用。

圖2 pomalidomide 對CD133-CAR T 細胞殺傷功能的影響

如圖3 所示，與R10 組（培養基對照）相比，DMSO組IL-2（白細胞介素-2）、TNF-α（腫瘤壞死因子）、GM-CSF（粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子）和IFN-γ（γ 干擾素）的細胞因子分泌水平沒有顯著差異，但是pomalidomide 對CD133-CAR T 細胞分泌4 種細胞因子都具有明顯的促進作用。

圖3 1 μmol/L pomalidomide 對CD133-CAR T 細胞細胞因子分泌水平的影響

2.3 pomalidomide 對未轉染T細胞功能的調節

為進一步探究激活方式是否會影響pomalidomide 對T 細胞的調節作用，對未轉染的T（NT）細胞（不表達CAR）進行研究。由圖4 可知，DMSO 對NT 細胞的細胞因子分泌水平不產生作用，而pomalidomide明顯促進了NT 細胞分泌IL-2、TNF-α、GM-CSF 和IFN-γ細胞因子。

圖4 1 μmol/L pomalidomide 可提高NT 細胞分泌細胞因子的水平

3 結論

（1）pomalidomide 對CD133-CAR T 細胞的殺傷功能有明顯的促進作用，并且當pomalidomide 濃度為1.0 μmol/L 時，對殺傷功能的增強效果最明顯。但在未激活的情況下，pomalidomide 對CD133-CAR T 細胞的殺傷功能不產生影響。pomalidomide還對CD133-CAR T 細胞及NT 細胞分泌IL-2、TNF-α、GM-CSF、IFN-γ等4種細胞因子都有明顯的促進作用。

（2）pomalidomide 可以顯著提高CAR-T 細胞對腫瘤細胞的殺傷效率；pomalidomide 與CD133-CAR T聯用時，可以提高細胞的細胞因子分泌水平，并明顯改善其對腫瘤細胞的殺傷效果。因此，pomalidomide與CAR T 細胞聯用可以改善CAR T 細胞治療實體瘤的效果。

（3）響尾蛇皮結構與皮膚角質層相似，將mcl-PHA 用于醫用紡織品中構筑的Pomalidomide 經皮給藥系統具有藥物透皮能力，且藥物透皮量達到實驗需求。因此有望制造一種使用方便、患者易接受、藥物濃度恒定、避免肝臟首過效應和藥物在胃腸道滅活的醫用紡織品聯合細胞治療，實現對實體瘤的免疫治療。

（4）構筑了后整理劑-醫用紡織品-經皮給藥-疾病治療效果的閉環，達到了通過設計紡織品后整理劑賦予紡織品特殊的醫學功能，并利用藥物原理達到提高醫學治療效果的目的。這對后整理劑進入醫學領域有著特別重要的意義，也對后整理劑的拓展提供了一種方法與手段。值得注意的是，本研究更注重確定一個邏輯關系是否成立，是一個試探性研究。研究還停留在體外階段，還要進一步從體內及動物實驗中獲取數據與佐證。作為后整理劑，對于紡織品的選擇及作為醫用紡織品在紡織品性能上還要做進一步研究，才能更好地成為一種新型產品和產業。