血漿1,5-脫水葡萄糖醇的UPLC-TQMS定量方法研究

瞿 純，葛 坤，菅朝慧，馬曉靜，包玉倩，賈 偉，趙愛華

1,5-脫水葡萄糖醇(1,5-anhydroglucitol，1,5-AG)與葡萄糖的化學結構相似，為六碳糖醇，具有吡喃環結構，由葡萄糖吡喃環狀結構中1位上脫氧形成[1]。人體內1,5-AG主要來源于飲食[2]，在腸道中被吸收，并分布到各種器官和組織中[3]。在健康狀態下，各組織間1,5-AG濃度水平相對穩定[4]。當發生糖尿病，血糖高于腎閾值時，會競爭性的抑制1,5-AG在腎近曲小管的重吸收，導致尿中1,5-AG排泄增加，血清中含量降低[5]。2003年，1,5-AG被美國食品藥物管理局(Food and Drug Administration，FDA)批準作為短期血糖監測的指標[6]。臨床上常用于監控血糖水平波動的指標還有糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1C)、糖化白蛋白(glycatedalbumin，GA)和果糖胺(fructosamine，FA)等。HbA1C反映近3個月內血糖的平均水平[7]，GA和FA可評估2～3周內血糖控制情況[8-9]，而1,5-AG則可反映1～2周內更短時間的血糖變化[2]。此外，據文獻報道，1,5-AG在反映餐后高血糖和血糖波動方面也具有一定的優勢[7]。

目前廣泛應用的血清1,5-AG的定量方法主要為FDA推薦的GlycomarkTM試劑盒方法[10]。其原理首先用已糖激酶將干擾定量的葡萄糖轉化為葡萄糖-6-磷酸，再將1,5-AG在吡喃糖氧化酶的作用下生成1,5-脫水果糖和過氧化氫，繼而在辣根過氧化酶的催化下生成比色產物，引起在特定波長下的吸光度升高[11]。該方法靈敏且精確，但必須去除血清中葡萄糖等類似物的干擾，才能特異性定量1,5-AG的含量。此外，早些年也有用氣相色譜-質譜法(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)定量血清1,5-AG[12]，該方法首先需要去除樣本中的蛋白，再將去蛋白后的提取液濃縮干燥，加入硅烷化試劑進行衍生。在特定的升溫程序下，根據化合物沸點的不同，分離目標化合物，結合外標法定量1,5-AG。此方法前處理較為復雜[13]。作者開發了一種利用超高效液相色譜串聯三重四級桿質譜(ultra-per-formance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry，UPLC-TQMS)定量血清1,5-AG的方法，樣本前處理簡單，不受血清中葡萄糖等干擾物質的影響，檢測時間較短，可為臨床批量樣本的篩查提供一種簡便、快捷的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 UPLC-TQMS(型號：XEVO-TQ，美國Waters公司)，色譜柱ACQUITY UPLC?BEH Amide(2.1×100 mm，1.7 μm粒徑)，預柱VanGuardTMPre-column ACQUITY UPLC?BEH Amide(2.1×5 mm，1.7 μm粒徑)都選自美國Waters公司，EXP電子分析天平(瑞士Mettler Toledo儀器公司)，Milli-Q超純水系統(美國Millipore儀器公司)。

1.2 試劑 1,5-脫水-D-葡萄糖醇標準品(純度≥98%)購自美國Sigma-Aldrich公司，內標(internal standard，IS)1,5-脫水-D-13C葡萄糖醇(1,5-anhydro-D-13C6-glucitol，13C6-1,5-AG，純度≥98%)購自美國Omicron Biochemicals公司。氨水購于美國Sigma-Aldrich公司，MS級別的乙腈和甲醇均購于美國Fisher Chemical公司。超純水由Milli-Q系統純化，=18.2。

1.3 研究對象 從上海交通大學附屬第六人民醫院內分泌科門診收集經口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tolerance test，OGTT)即口服75 g葡萄糖液體后，監測血糖變化。根據WHO標準診斷為健康正常對照10例，糖尿病前期8例和糖尿病22例的空腹和2 h的靜脈血靜置2 h后，于1 200 r/min下離心20 min，取血漿-80 ℃保存，待用。樣本的臨床指標見表1。

表1 健康對照與糖尿病人的臨床指標

1.4 方法

1.4.1 樣本前處理方法 稱取1 mg同位素內標13C6-1,5-AG溶于1 mL甲醇中配制濃度為1 mg/mL的13C6-1,5-AG，取200 μL同位素內標母液加入含800 mL乙腈和200 mL甲醇的溶液中配制成提取溶劑。于50L的血漿中加入300 μL -20 ℃預冷過的提取液(含200 ng/mL13C6-1,5-AG)，渦旋30 s，使樣本與提取液充分混合，放置-20 ℃冰箱20 min后，于4 ℃、13 500 r/min離心10 min，取上清到進樣瓶中待檢測。

1.4.2 色譜條件 柱溫45 ℃，進樣體積5 μL，流速0.5 mL/min。流動相A由乙腈∶異丙醇∶水(95∶5∶5,v∶v∶v)+0.05%氨水組成，相B由水+0.05%氨水組成。梯度洗脫程序見表2。

表2 梯度洗脫程序

1.4.3 質譜條件 采用負離子多重反應監測模式，電噴霧離子源。離子源溫度150 ℃，毛細管電壓2.0 kV，脫溶劑氣溫度500 ℃，脫溶劑氣流速1 000 L/h，錐孔流速50 L/h。1,5-AG及13C6-1,5-AG的定量離子見表3。

表3 1,5-AG和13C6-1,5-AG的定量離子

1.4.4 提取溶劑的選擇 為了有效地提取血清中的1,5-AG，本研究摸索了乙腈與甲醇在1∶0、8∶2、1∶1、2∶8、0∶1不同比例下的提取效果。采用所有測試樣本等量混合作為方法學考察所用樣本(quality control，QC)。平行取5份QC樣本，每份50 μL，分別加入以上預冷過的不同比例的提取溶劑300 μL，渦旋30 s，-20 ℃下放置20 min后，于4 ℃下，13 500 r/min離心10 min，取上清液進樣。比較不同比例溶劑組合下1,5-AG的峰型及響應強度，確定最佳提取溶劑。

1.4.5 檢測限、定量限和線性 將1,5-AG的標準品儲存液用水稀釋為一系列濃度的標準溶液，以3倍信噪比(S/N≥3)和10倍信噪比(S/N≥10)對應的濃度分別為檢測限(limits of detection，LOD)和定量限(limits of quantitation，LOQ)。在確定LOQ后，用1、2、4、8、10、15、20、25、40 μg/mL的標準溶液，由低到高的順序進樣，以標準液的濃度(μg/mL)為橫坐標，定量離子對的峰面積為縱坐標，建立線性回歸方程，考察其線性。

1.4.6 重復性 分別取6份低(2 μg/mL)、中(10 μg/mL)、高(25 μg/mL)的標準品溶液和6份QC樣本，以確定好的提取溶劑比例，平行提取樣本，取上清液進樣測定。比較6針1,5-AG的峰面積，計算峰面積的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)。

1.4.7 日內精密度與日間精密度 取3等份QC樣本，1 d內處理1個QC樣本，重復進樣6次，計算6針所得的1,5-AG峰面積的RSD，考察日內精密度。3 d內每天處理1個QC樣本，每天的樣本重復進樣6針，連續3 d。計算3 d內1,5-AG峰面積的RSD，考察日間精密度。

1.4.8 穩定性 按確定好的方法，平行處理6份低、中、高的標準品溶液和6份QC樣本，分別將提取液放置4 ℃下保存。于0、12、24、48、72 h和1周不同時間點進行測試，每次重復進樣6針。計算各時間點1,5-AG峰面積的RSD。

1.4.9 準確度 取6份低、中、高的標準品溶液，采用確定好的提取溶劑，按相同的方法處理。用標準曲線法定量低、中、高標準品溶液的實際濃度與理論濃度的比值，考察準確度。

1.4.10 加樣回收率 平行取18份QC樣本，每6份中加入低、中、高不同濃度的1,5-AG標準品溶液，采用所確定的提取溶劑，按相同的方法進行處理。用標準曲線法定量未加標準品溶液的QC樣本以及加入不同濃度溶液后QC樣本中的濃度，計算加樣回收率。

1.4.11 方法驗證 采用所確定的測定方法，定量10例健康對照、8例糖尿病前期和22例糖尿病血漿樣本中1,5-AG的含量。

1.5 統計學處理 采用SPSS 22.0統計學軟件，相關性行Spearman相關分析，顯著性用t-test雙尾檢驗，以P<0.05為差異比較具有統計學意義。

2 結果

2.1 最佳提取溶劑的確定 5種不同比例的提取溶劑對應1,5-AG的定量離子色譜圖，如圖1所示。結果顯示隨著甲醇比例的增加，色譜峰逐漸加寬，峰響應越來越低，而乙腈比例越高，色譜峰越窄、對稱性好。雖然單純的乙腈作為提取溶劑時，峰型最窄，但峰響應強度大約只有乙腈∶甲醇(8∶2，v∶v)的一半。綜合考慮，乙腈∶甲醇(8∶2，v∶v)的提取效果最好，1,5-AG色譜峰半峰寬較窄，峰型對稱，且響應強度最大，是較理想的提取溶劑。

MEOH：甲醇；ACN：乙腈圖1 不同比例的提取溶劑的1,5-AG定量離子色譜圖

2.2 LOD值、LOQ值和線性關系 LOD值和LOQ值分別為0.002 5 μg/mL，0.005 μg/mL。在1～40 μg/mL濃度范圍內，線性回歸方程為y=0.556 2x+0.067 8，相關系數r為0.998 8。表明1,5-AG在1～40 μg/mL的濃度范圍內具有良好的線性關系，滿足定量的要求。

2.3 重復性 1,5-AG低、中、高標準品和混合血QC樣本的RSD為3.85%～6.08%，表明該方法具有良好的重復性。

2.4 日內和日間精密度 日內精密度RSD為3.77%，日間精密度RSD為7.76%。表明該方法具有良好的精密度，滿足定量的要求。

2.5 穩定性 根據0、12、24、48、72 h和1周內1,5-AG低、中、高標準品溶液及QC樣本1,5-AG的濃度所示，RSD為2.51～4.24%，表明1,5-AG在4 ℃環境下保存1周具有良好的穩定性。

2.6 準確度 1,5-AG低、中、高標準品的準確度為97.28%～99.98%，RSD為2.72%～6.53%，表明該方法具有良好的準確度。

2.7 加樣回收率 平均加樣回收率為96.92%～101.53%，RSD為6.52%～9.82%，表明該方法具有良好的回收率。

2.8 方法驗證結果 應用將血清樣本采用所建立質量的方法進行1,5-AG濃度的測定。空腹時，糖尿病前期和糖尿病血中1,5-AG的濃度均分別低于健康對照(P<0.01和P<0.05)，但糖尿病前期與糖尿病之間差異比較無統計學意義(圖2A)。同樣，在OGTT 2 h時，糖尿病前期和糖尿病血中1,5-AG的濃度亦分別低于健康對照(均P<0.05)，并且糖尿病前期與糖尿病之間差異比較無統計學意義(圖2B)。將本方法所測得的2 h血1,5-AG濃度與血糖值進行Spearman相關分析，結果顯示血1,5-AG與餐后2 h血糖呈明顯負相關(r=-0.51,P<0.01)，圖3。

A:空腹血漿，糖尿病前期與對照比較，**P<0.01(t=2.952，雙側)；糖尿病與對照比較，*P<0.05(t=2.110，雙側)；B:餐后2h血漿，糖尿病前期與對照比較*P<0.05(t=2.844，雙側)，糖尿病與對照比較*P<0.05(t=2.425，雙側)圖2 正常對照、糖尿病前期和糖尿病血漿1，5-AG濃度

r=-0.51,P<0.01圖3 餐后2 h血漿1,5-AG與餐后2 h血糖的相關性

3 討論

糖尿病患者的血糖水平監控是診斷、治療中的重要依據。近年來，血清1,5-AG作為血糖監控的短期標志物而倍受關注，并且越來越多的研究者不僅關注血中1,5-AG的含量，同時還關注唾液、玻璃體液、腦脊液等不同生物體液中1,5-AG的含量。Halama等[10]的研究表明唾液1,5-AG可用于糖尿病的無創篩查。早期Servo等[14]研究者發現糖尿病患者腦脊液中1,5-AG的水平降低。此外，Takata等[15]在47具尸體中研究發現玻璃體和腦脊液中1,5-AG的水平呈正相關，可為法醫評估死者生前血糖水平提供重要的參考依據。由此可見1,5-AG在不同生物體液中具有重要的臨床價值。目前GlycomarkTM試劑盒檢測方法是通用的血中1,5-AG的定量方法，而1,5-AG在不同生物體液中的定量不僅受到樣本中葡萄糖的干擾，還受到膽紅素[16]、血紅蛋白[16]、麥芽糖[17]、肌醇[18]、半乳糖[10]等類似物的影響，在準確定量前需要排除這些干擾因素。但去除干擾物的過程涉及到復雜的生化反應過程，需要嚴格控制溫度、反應時間等條件，干擾物去除的與否完全會影響到測定1,5-AG的準確性。本研究建立了基于UPLC-TQMS的一種定量方法。樣本前處理只需沉淀蛋白后即可上機檢測，整個檢測運行過程僅需6 min即能完成。該方法具有較高的靈敏度、重復性好、高精密度、準確度和穩定性，并且實際操作簡單、快捷，適合于不同生物大樣本的快速篩查需求，具有較強的推廣應用價值。

本研究采用所開發的方法對健康對照、糖尿病前期和糖尿病患者中的血1,5-AG進行了定量，結果顯示糖尿病前期和糖尿病患者的血1,5-AG的含量均顯著低于健康對照，這與文獻報道的用GlycomarkTM試劑盒測試糖尿病前期和糖尿病患者的結果相吻合[19]。但本次結果中提示糖尿病前期和糖尿病患者之間無顯著性差異，這很可能與所用的樣本數量較少、個體之間的差異較大有關。進一步分析可知，餐后2 h的血糖與1,5-AG之間存在顯著的負相關關系，這與葡萄糖和1,5-AG在腎小管中共用相同的轉運體有關。當尿中葡萄糖超過閾值后，轉運體對二者的轉運具有競爭性，對葡萄糖的轉運增加，使血糖升高就會使得對1,5-AG的轉運減少，血1,5-AG含量下降。該結果提示餐后的1,5-AG水平能較好反映餐后血糖的波動情況，與文獻報道的結果相吻合[20]。

綜上所述，UPLC-TQMS檢測血清1,5-AG快速簡單，實現對血清1,5-AG準確的定量，可為臨床高通量樣本的篩查提供切實可行的方法，同時也能為各種復雜生物樣本中1,5-AG的定量方法提供參考。