基于金屬有機(jī)多面體的可視化檢測(cè)方法的構(gòu)建及應(yīng)用

盧朝粉　張菊梅　秦渝　鄭立炎　曹秋娥　周川華

摘 要 結(jié)合金屬有機(jī)多面體的高催化活性和抗壞血酸的還原性建立了一種簡(jiǎn)單、高靈敏的抗壞血酸（AA）可視化檢測(cè)方法。采用銅離子-有機(jī)多面體納米棒（Copper metal-organic polyhedra nanorods，Cu-MOP）作為類辣根過(guò)氧化物酶，在H2O2存在下，Cu-MOP催化氧化3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB），檢測(cè)液中存在的AA使Cu-MOP中的Cu2+還原，類辣根過(guò)氧化物酶催化活性大大降低，抑制Cu-MOP對(duì)TMB的催化氧化，因此，可以利用檢測(cè)液顏色及其吸光度實(shí)現(xiàn)對(duì)AA的特異性檢測(cè)。AA的濃度在1.0～30.0 μmol/L及40.0～200 μmol/L范圍內(nèi)與體系452 nm的吸光度（A452 nm）呈線性關(guān)系，檢出限（S/N=3）為0.68 μmol/L。本方法簡(jiǎn)單、快速、無(wú)需復(fù)雜儀器，將其應(yīng)用于藥品中AA的測(cè)定，結(jié)果令人滿意。

關(guān)鍵詞 銅離子-有機(jī)多面體納米棒; 3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺; 抗壞血酸; 可視化檢測(cè)

1 引 言

天然酶是由生物體活細(xì)胞所產(chǎn)生的具有特異性催化功能的蛋白質(zhì)。但是天然酶存在成本高、易失活、儲(chǔ)存條件嚴(yán)格等缺點(diǎn)，在一定程度上限制了它們的應(yīng)用[1，2]。納米酶因低成本、高穩(wěn)定性及好的催化活性逐漸受到關(guān)注[3]，其開(kāi)發(fā)和應(yīng)用逐漸成為相關(guān)研究熱點(diǎn)。近年的研究發(fā)現(xiàn)，很多納米材料（如納米金[4]、碳點(diǎn)[5]、碳納米管[6]、石墨烯[7]、磁性納米顆粒[8]等）都具有類辣根過(guò)氧化物酶活性。但是，這些材料多需在酸性條件下合成[9，10]，其催化活性也有待進(jìn)一步提高，在一定程度上限制了其在生物醫(yī)學(xué)等方面的應(yīng)用。因此，尋找催化活性更高，而且可在更寬的pH范圍內(nèi)使用的納米模擬酶是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。

金屬有機(jī)多面體（Metal-organic polyhedra， MOP）是通過(guò)金屬離子和有機(jī)配體進(jìn)行自組裝而形成的一類離散分子籠形結(jié)構(gòu)，具有內(nèi)部空腔[11，12]，可通過(guò)選擇不同的金屬離子和有機(jī)配體調(diào)控其結(jié)構(gòu)、形態(tài)及大小[13]，具有孔隙率高、比表面積大[14]和化學(xué)可調(diào)控性等特點(diǎn)，因其具有高度的對(duì)稱性和穩(wěn)定性、豐富的物理化學(xué)性質(zhì)[15]，以及在吸附[16]、催化[13，17]、藥物釋放[18]、分子封裝[19]等方面的潛在應(yīng)用而受到了廣泛關(guān)注。前期工作中，本研究組合成出具有類辣根過(guò)氧化物酶活性的Cu-MOP納米棒[20]，該材料可在中性甚至偏堿性的條件下保持非常高的催化活性，將其應(yīng)用于血清中葡萄糖的高靈敏檢測(cè)，檢出限低至1.5×10Symbolm@@6 mol/L。

抗壞血酸（AA）即維生素C，是人體重要的微量營(yíng)養(yǎng)素之一，可用于預(yù)防和治療普通感冒、不孕癥、精神疾病[21]、癌癥和獲得性免疫缺陷綜合征[22]等。當(dāng)人體缺乏AA時(shí)，會(huì)導(dǎo)致膿毒癥[23]、壞血病[24]、動(dòng)脈粥樣硬化[25]、白內(nèi)障壞死和肝臟疾病等[26]。因此，建立簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速檢測(cè)AA的分析方法具有重要的意義。本研究采用Cu-MOP納米棒作為類辣根過(guò)氧化物酶，將其與AA的還原性相結(jié)合，建立一種快速、簡(jiǎn)單、無(wú)需復(fù)雜儀器的方法檢測(cè)AA。將本方法用于維生素C片中AA的檢測(cè)，為AA的可視化檢測(cè)提供了新思路。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

UV-3600plus紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）; SU3500掃描電子顯微鏡（日本日立公司）; K-Alpha+型X-射線光電子能譜儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）; KQ-218超聲波清洗儀（深圳潔盟清洗設(shè)備有限公司）; SYG-2恒溫水浴鍋（常州朗越儀器制造有限公司）; FA32精密分析天平（豪斯儀器（上海）有限公司）; PB-10 pH計(jì)（德國(guó)Sartorius公司）。

AA、K2S2O8（Adamas試劑有限公司）; 葡萄糖、無(wú)水乙醇、NaAc·3H2O、冰乙酸、CuSO4·5H2O、Na2SO4、KNO3、甘油、淀粉）、硬脂酸鎂（MS）、甲基纖維素（MC）、SiO2（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）; 四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、H2O2（質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%）（美國(guó)Sigma-Aldrich公司）。其它試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水（電阻率為18.25 MΩ cm，美國(guó)Millipore公司Milli-Q超純水儀制備）。

2.2 Cu-MOP的合成

參照文獻(xiàn)[20]的方法合成Cu-MOP。首先配制0.2 mmol/L 5-溴-1，3-苯二羧酸和0.2 mmol/L CuSO4的混合物，溶于5 mL 甲醇-二甲基甲酰胺（4∶1， V/V）中， 75℃反應(yīng)48 h，冷卻至室溫，產(chǎn)物用甲醇沖洗。得到的Cu-MOP在水中浸泡48 h，然后冷凍干燥，得到Cu-MOP納米棒。

2.3 AA的檢測(cè)

將60 μL不同濃度的AA加入到60 μL含有20 μg/mL Cu-MOP的0.1 mol/L NaAc-HAc緩沖溶液（pH 7.0）中，再加入20 μL 10 mmol/L TMB乙醇溶液和20 μL 0.6 mol/L H2O2溶液，混勻，在25℃恒溫水浴中反應(yīng)8 min。加入20 μL 3 mol/L HCl，混勻，測(cè)定溶液在350～550 nm的吸收光譜，觀察檢測(cè)液的顏色并拍照。

2.4 實(shí)際樣品分析

維生素C片購(gòu)于本地藥店，其中樣品1規(guī)格為650 mg/片，樣品2規(guī)格為1200 mg/片。

將兩種維生素C片研磨， 各稱取0.1000 g，用10.0 mL 0.1 mol/L NaAc-HAc緩沖溶液（pH 7.0）溶解，以10000 r/min離心1 min，取300 μL樣品1的上清液，稀釋至1000 μL，按照2.3節(jié)所述方法進(jìn)行測(cè)定。另取100 μL樣品2的上清液，稀釋30倍，按照2.3節(jié)所述方法進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果與討論

3.1 基于Cu-MOP可視化檢測(cè)抗壞血酸的原理

檢測(cè)原理如圖1所示。所制備的Cu-MOP具有良好的類過(guò)氧化物酶活性，在H2O2存在的條件下，

可快速將TMB氧化為T(mén)MB+，加入HCl后，變成黃色的TMB2+[27，28]。當(dāng)待測(cè)液中含有AA時(shí)，由于Cu-MOP中的Cu2+被還原[29]，Cu-MOP的結(jié)構(gòu)被破壞，其催化TMB氧化的能力大大降低; 另一方面，AA還可將氧化態(tài)TMB還原，因此，檢測(cè)液中TMB2+的含量大大減少。

利用檢測(cè)液的顏色及其在452 nm處的吸光度的變化可實(shí)現(xiàn)對(duì)AA的可視化以及定量檢測(cè)。

3.2 方法的可行性

如圖2所示，當(dāng)反應(yīng)液中不存在Cu-MOP時(shí)，單獨(dú)的H2O2不能氧化TMB，溶液仍為無(wú)色，在452 nm處幾乎沒(méi)有吸收（曲線c）; 當(dāng)向含有TMB和H2O2的溶液中加入Cu-MOP，并孵育8 min后，檢測(cè)液變?yōu)辄S色，且其在452 nm處的吸光度顯著增加，表明Cu-MOP催化H2O2對(duì)TMB的氧化（曲線a）; 而向含有AA的待測(cè)液中分別加入Cu-MOP、H2O2及TMB，并孵育8 min后，檢測(cè)液為淺黃色，452 nm處的吸光度較小（曲線b），表明AA可明顯抑制Cu-MOP-H2O2-TMB體系的催化氧化反應(yīng)。

采用掃描電鏡（SEM）及X-射線光電子能譜（XPS）對(duì)與AA反應(yīng)前后的Cu-MOP進(jìn)行表征。如圖3所示，合成的Cu-MOP呈棒狀（圖3A），含有Cu、C、O、Br等元素（圖3B）; Cu（2p）在934.36 eV處有一個(gè)明顯的峰，并且在此峰左側(cè)有兩個(gè)明顯的衛(wèi)星峰（圖3C）; 說(shuō)明Cu-MOP中的銅為Cu2+。當(dāng)0.1 mmol/L AA與Cu-MOP在0.1 mol/L NaAc-HAc緩沖溶液（pH 7.0）中反應(yīng)后，Cu-MOP的結(jié)構(gòu)基本被破壞（圖3D）; 由XPS圖中可看出， Cu（2p）所在峰的強(qiáng)度明顯下降（圖3E）; 由圖3F中窄譜可看出，Cu（2p）峰（934.7 eV）左側(cè)未出現(xiàn)衛(wèi)星峰，表明Cu-MOP中的Cu2+被還原，使Cu-MOP的類過(guò)氧化物酶催化活性大大降低。因此，可利用AA對(duì)Cu-MOP-H2O2-TMB體系的抑制實(shí)現(xiàn)對(duì)AA的檢測(cè)。

3.3 檢測(cè)條件的優(yōu)化

檢測(cè)液的pH值對(duì)Cu-MOP催化反應(yīng)和AA與Cu-MOP的反應(yīng)都會(huì)產(chǎn)生影響。固定其它反應(yīng)條件，改變檢測(cè)液的pH值，比較有無(wú)AA時(shí)，檢測(cè)液在452 nm處的吸光度（A452 nm）。 如圖4A所示， Cu-MOP在中性偏堿性條件下具有較好的催化能力，雖然Cu-MOP對(duì)TMB-H2O2體系的催化能力在pH 7.5時(shí)最大，但在加入AA后，pH 7.0時(shí)抑制效果最好，故選擇pH 7.0為檢測(cè)液的最佳pH值。

考察了Cu-MOP的濃度對(duì)TMB-H2O2催化反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖4B所示，隨著檢測(cè)液中Cu-MOP濃度增加，檢測(cè)液A452 nm值逐漸增大，為了使紫外-可見(jiàn)吸收光譜測(cè)量的相對(duì)誤差較小，選擇60 μg/mL Cu-MOP進(jìn)行催化反應(yīng)。作為Cu-MOP的底物，檢測(cè)液中H2O2的濃度增加，會(huì)使其催化反應(yīng)加速，當(dāng)H2O2濃度大于60 mmol/L時(shí)，檢測(cè)液A452 nm趨于穩(wěn)定（圖4C），因此， 選擇H2O2的濃度為60 mmol/L。如圖4D所示，A452 nm隨TMB濃度的增加而增大，當(dāng)TMB的濃度大于1 mmol/L時(shí)趨于平衡，因此選擇TMB的濃度為1 mmol/L。

3.4 方法的分析性能

在最佳反應(yīng)條件下，對(duì)不同濃度的AA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示。隨著AA濃度增加，Cu-MOP的類過(guò)氧化物酶催化活性逐漸被抑制，檢測(cè)液的顏色由黃色逐漸變?yōu)闊o(wú)色（圖5A），檢測(cè)液中TMB2+在452 nm處的吸光度逐漸下降（圖5B），A452 nm與AA的濃度在1.0～30.0 μmol/L及40.0～200 μmol/L之間呈線性關(guān)系（R2分別為0.994和0.991）。當(dāng)AA濃度較低時(shí)，可能由于Cu-MOP中只有部分Cu2+與AA發(fā)生反應(yīng)，對(duì)Cu-MOP的結(jié)構(gòu)破壞作用有限，所以抑制作用相對(duì)較小; 當(dāng)AA的濃度大于40.0 μmol/L時(shí)，Cu-MOP的結(jié)構(gòu)被破壞程度很大（圖3D），Cu-MOP的催化活性被大大抑制，所以標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率相對(duì)較大。本方法的檢出限為0.68 μmol/L（S/N=3）。與文獻(xiàn)中報(bào)道的AA檢測(cè)方法相比[30～35]，本方法具有更低的檢出限和較寬的線性范圍（表1）。

3.5 方法的選擇性

考察了方法的選擇性。以維生素C片中幾種常見(jiàn)的輔料（如淀粉（Starch）、硬脂酸鎂（MS）、葡萄糖（Glucose）、甘油（Glycerol）、SiO2、甲基纖維素（MC）等）作為干擾物質(zhì)，采用本方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示，10倍濃度于AA的常見(jiàn)輔料并未干擾AA的測(cè)定結(jié)果，表明本方法對(duì)AA檢測(cè)具有良好的選擇性。

3.6 實(shí)際樣品分析

為了考察本方法的實(shí)用性，對(duì)維生素C藥片中AA的含量進(jìn)行了測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果如表2所示，樣品的加標(biāo)回收率在92.0%～105.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.0%，表明本方法可用于實(shí)際樣品中AA的測(cè)定。

4 結(jié) 論

結(jié)合Cu-MOP良好的類辣根過(guò)氧化物酶催化活性和AA的還原性，建立了一種基于MOP的AA可視化檢測(cè)方法。結(jié)果表明，AA可破壞Cu-MOP的結(jié)構(gòu)，抑制其類辣根過(guò)氧化物酶催化活性，據(jù)此可實(shí)現(xiàn)對(duì)AA的特異性檢測(cè)。本方法快速、簡(jiǎn)單， 無(wú)需復(fù)雜儀器，被成功應(yīng)用于藥片中AA的測(cè)定。

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Construction and Application of Metal-Organic

Polyhedra-based Colorimetric Assay

LU Chao-Fen， ZHANG Ju-Mei， QIN Yu， ZHENG Li-Yan， CAO Qiu-E， ZHOU Chuan-Hua*

（School of Chemical Science and Technology， Experiment Centre of Chemistry and Chemical Engineering，

Functional Molecules Analysis and Biotransformation Key Laboratory of Universities in Yunnan Province，

Yunnan University， Kunming 650091， China）

Abstract A simple and highly sensitive colorimetric assay method for ascorbic acid （AA） detection was developed based on the high catalytic activity of metal-organic polyhedron （MOP） and the reducibility of ascorbic acid. Copper metal-organic polyhedra nanorods （Cu-MOP） exhibited high peroxidase-mimicking activity， which were capable of catalyzing the oxidation of the 3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine （TMB） in the presence of H2O2. The presence of AA in detection solution triggered the decomposition of Cu-MOP by reducing Cu2+， which weakened peroxidase-mimicking activity of Cu-MOP dramatically. As a result， the catalytic oxidation reaction of TMB by Cu-MOP in the presence of H2O2 was inhibited， and AA could be detected specifically by detecting the solution color and its absorbance. The calibration graph for the determination of AA was linear in the range of 1.0-30.0 μmol/L and 40.0-200 μmol/L， and the detection limit （S/N=3） was 0.68 μmol/L. The sensor showed many advantage such as simple， fast and without the need of complicated instruments， and could be applied to the determination of AA in drugs with satisfactory results.

Keywords Copper metal-organic polyhedra nanorods; 3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine; Ascorbic acid; Colorimetric assay

（Received 23 October 2019; accepted 28 May 2020）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21505119， 21465025）.

2019-10-23 收稿;? 2020-05-28 接受

本文系國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ Nos. 21505119， 21465025）資助

* E-mail： chzhou@ynu.edu.cn