微重力調控骨重建的細胞和分子機制研究進展

王藝璇，王 可，張 舒

空軍軍醫大學 航空航天生物動力學教研室，航空航天醫學教育部重點實驗室，陜西西安 710032

骨骼是一個極其特殊和充滿活力的器官，骨重建存在于人的一生，是正常成人骨代謝的主要方式，對骨內環境保持穩定至關重要。骨重建是修復因日常體力負荷而造成的陳舊性骨損傷，預防衰老效應及其后果的重要手段。骨重建包括骨吸收及骨形成兩個階段，這兩個階段的平衡對于維持骨量和全身礦物質穩態至關重要。骨重建過程中骨吸收增加、骨形成減少，常引發骨質丟失，甚至造成骨質疏松[1]。微重力導致的骨質丟失是限制中長期載人航天任務和火星探險活動的最主要因素之一。航天員長時間停留于太空中，微重力環境中骨骼受到的力學刺激減少，打破了骨重建過程中骨吸收與骨形成之間的平衡，導致骨量以平均每個月1% ～ 2%的速率丟失。目前的藥物治療、體育鍛煉尚不能有效阻止骨質的持續丟失[2]。航天飛行及地面模擬微重力實驗(如人體臥床實驗、動物尾吊模型及細胞回轉等)均可用于研究機械刺激對骨重建的影響。本文就近年來關于微重力影響骨重建的細胞和分子機制研究進行綜述。

1 骨重建概述

生理性骨重建是一個高度協調的過程，是多種骨組織細胞(包括破骨細胞、成骨細胞、骨細胞和免疫細胞等)共同作用下舊骨吸收、新骨形成的骨組織自我更新，是修復受損骨和維持礦物質穩態所必需的過程。骨重建發生在數周內，由排列在被稱為“基本多細胞單元”(basic multicellular unit，BMU)的臨時解剖結構內的破骨細胞和成骨細胞等動態耦聯完成。每一個完整的BMU 都由骨內襯細胞包裹形成骨重建室，前方由一組破骨細胞溶解吸收骨組織，而成骨細胞跟隨其后，不斷分泌和沉積未礦化的膠原成骨以填充骨吸收后留下的空間。BMU 內細胞這種獨特的空間和時間排列，為耦合的骨吸收-骨形成創造了一個獨特的微環境，保證了骨重建五個連續階段—激活、吸收、逆轉、形成和終止的協調[3-4]。

激活期是骨重建的第一階段。骨骼在此之前處于靜止狀態，檢測到初始的重塑信號，如機械刺激或激素水平改變(如雌激素或甲狀旁腺激素)[5-6]。對骨骼造成機械應變或微損傷的力學信號可以被轉換為能夠由骨細胞感知的生物信號[6-7]。破骨前體細胞隨之被招募到需要骨重建的部位，啟動骨重建。骨吸收期主要由破骨細胞所介導，成熟的破骨細胞形成后可產生αVβ3整合素分子，分泌組織蛋白酶K 等溶酶體酶消化有機骨基質，同時骨組織局部微環境中pH 值降低，無機礦物質溶解，形成骨吸收陷窩[8]。骨吸收后，空腔中含有多種細胞，包括單核細胞和骨細胞等。骨陷窩由富含糖蛋白和酸性磷酸成分的黏性物質沉積填平，但缺乏膠原成分的沉積。然而逆轉期中骨吸收結束和骨形成開始的耦合信號尚不十分清楚。目前研究發現，轉化生長因子-β 含量與骨轉換率有關，其可抑制成骨細胞產生NF-κB 受體激活蛋白配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)， 從而減少破骨細胞的吸收[9]。之后破骨細胞逐漸被成骨細胞所取代，進入由成骨細胞介導的骨形成期。成骨細胞合成分泌Ⅰ型膠原蛋白(type Ⅰcollagen，Col Ⅰ)等有機成分，產生大量的骨質特異性堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)，細胞外基質逐漸成熟[10]。隨著新骨基質礦化，羥基磷灰石晶體被整合到新沉積的類骨中以進行骨質礦化。成骨細胞一部分繼續形成新骨，直到它們轉化為完全覆蓋新形成骨表面的靜止骨襯里細胞；另一些成骨細胞則被埋入新形成的骨基質中，成為骨細胞，其廣泛的小管網絡將其與骨表面襯里細胞、成骨細胞和其他骨細胞連接起來。單個骨重建單位完成上述階段的改建過程后，暫時進入終止期，直到下一波骨重建開始。

2 微重力對骨組織細胞的影響

2.1 微重力對破骨細胞的影響 破骨細胞是大的多核巨細胞，來源于骨髓造血干細胞，由單核-巨噬細胞系的單核前體細胞分化而來，是目前唯一已知的能夠吸收骨的細胞。骨髓基質細胞和成骨細胞所分泌的巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)、RANKL 和骨保護素等細胞因子，對破骨細胞前體在體外和體內的存活、增殖和分化至關重要[11]。破骨細胞功能增強在微重力導致的骨質丟失中起著十分重要的作用[12]。航天飛行研究發現，微重力可增強破骨細胞骨吸收陷窩的形成，骨載玻片的總吸收面積同樣顯著增大[13]。歐洲航天局福田M3 航天飛行任務研究發現，與地面對照組相比，微重力環境中破骨細胞成熟和活性相關的基因表達增加，骨吸收能力增強[14]。國際空間站研究同樣證實，微重力可激活破骨細胞[15]。SD 大鼠尾吊4 周后，血清中骨堿性磷酸酶與耐酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase，TRAP)升高，提示骨吸收能力增強[16]。Saxena 等[17]發現小鼠尾吊后肢去負荷28 d 后，其骨髓巨噬細胞在RANKL 和M-CSF誘導刺激后產生的TRAP 陽性多核破骨細胞數量增加。旋轉細胞培養系統雖不能誘導RAW 264.7 破骨前體細胞生成，但破骨細胞生成相關的信號分子發生活化，TRAP 陽性多核破骨細胞增多，破骨細胞標記基因TRAP 和組織蛋白酶K 表達增加[17]。Sambandam 等[18]研究發現小鼠RAW 264.7 細胞在使用旋轉細胞培養系統培養后破骨分化相關的轉錄因子如c-Jun 氨基末端激酶和環磷腺苷效應元件結合蛋白表達上調，細胞質中鈣離子水平及鈣振蕩增加。使用旋轉細胞培養系統模擬微重力培養小鼠骨髓后，自噬標志物Atg5 和LC3-Ⅱ的表達以及自噬體的形成顯著增加，破骨細胞生成增多[19]。此外利用隨機定位儀模擬微重力培養FLG 29.1 人前破骨細胞發現細胞骨架改變、凋亡增加，而存活的RANK 及其配體RANKL 表達增加、破骨細胞分化增強[20]。

2.2 微重力對成骨細胞、骨髓間充質干細胞的影響 成骨細胞屬于成纖維樣細胞，由間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分化而成，是一類特殊的具有成骨潛能的細胞，其分化過程以成骨細胞特異基因的順序激活為標志。成骨細胞分化受到runt 相關轉錄因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)和鋅指結構轉錄因子(Osterix)的調節，其分化早期即開始合成分泌成骨基質主要成分Col Ⅰ和調節骨基質成熟穩定的ALP，而晚期則分泌合成在骨基質礦化成熟中起重要作用的骨鈣素[21-22]。骨形態發生蛋白、甲狀旁腺激素、Wnt信號通路等蛋白質、激素和信號通路在調節成骨細胞分化等功能方面同樣發揮重要作用[23-24]。微重力環境中成骨細胞功能會受到抑制[12]。航天飛行時人體血清中骨形成標志物—骨堿性磷酸酶及Ⅰ型膠原前肽降低，提示骨形成減少[25]。暴露在航天微重力環境5 d 后，成骨細胞局灶性黏附完整性降低，肌動蛋白和應力纖維減少，呈現擴散的細胞形態[13]。歐洲航天局SpaceX Dragon 航天飛行任務研究發現，成骨細胞暴露在微重力環境14 d 后成骨分化關鍵因子Runx2、Osterix 和Col ⅠmRNA表達降低[26]。利用放射性DNA 合成標志物研究大鼠尾吊后肢去負荷4 周后股骨中的成骨細胞，發現成骨細胞分化及向骨細胞的轉化均明顯延緩[27]。多項研究表明微重力環境中，成骨細胞的細胞周期和細胞分化過程均會受到負面影響，具有成骨功能的細胞數量明顯減少[28]。研究表明，成骨細胞分化各階段中的多個轉錄因子及標志蛋白，如Runx2、Osterix、Col Ⅰ的表達在模擬微重力環境中均明顯降低[29]。Wnt/β-catenin 信號通路在成骨細胞中發揮著重要的作用，微重力環境下成骨細胞Wnt/β-catenin 信號通路的激活受到抑制，進一步影響了成骨細胞的增殖與分化功能[30]。非編碼RNA 同樣可以參與骨形成的各個階段，微重力環 境 下 眾 多microRNAs， 如miR-214、miR-33、miR-139 等，可以通過其各自的靶基因調控成骨細胞的功能[29,31-32]。此外，長鏈非編碼RNA，如lncRNA ODSM、OGRU 在微重力環境中也可通過結合不同的miRNAs 調控成骨分化[33-34]。

骨髓間充質干細胞是一類可自我更新，具有多向分化潛能的干細胞，可分化為成骨細胞、成脂細胞和成軟骨細胞等。如果在骨重建過程中這種分化不平衡，脂肪細胞數量增加，成骨細胞數量減少，可能會導致骨量減少甚至骨質疏松[35]。利用SJ-10 返回式科學衛星的實際微重力環境，研究空間微重力對人骨髓間充質干細胞成骨分化的影響，發現人骨髓間充質干細胞微重力環境中成骨特異性基因表達減少，而成脂特異性基因表達增加[36]。Pan 等[37]研究發現大鼠尾吊后肢去負荷28 d 后，尾吊大鼠后肢股骨的骨髓間充質干細胞分離培養后成骨標記細胞基因Runx2 表達減少，成骨潛能降低。模擬微重力可降低MSCs 中Runx2、ALP、Col Ⅰ等成骨分化標志基因的表達[38]。微重力環境中MAPK、Notch、PPARγ 等信號通路的激活可能是抑制MSCs 向成骨細胞分化的主要分子機制[39-40]。

2.3 微重力對骨細胞的影響 骨細胞是成骨細胞中無法增殖的終端分化細胞，占骨骼中所有細胞的90% ～ 95%，是成熟骨中最常見的細胞。成骨細胞在骨形成過程中經歷了終末分化，被埋入骨基質中成為類骨樣骨細胞，形成長的樹突狀骨細胞突起，呈星形樹突狀突起延伸至骨基質中的小管，與骨基質中的其他骨細胞或骨表面的成骨細胞相互作用，從而形成腔隙-小管網絡。在骨重建過程中骨細胞可感知機械及代謝信號，并能通過合成一氧化氮和硬化蛋白等調節成骨細胞功能[6-7]。微重力導致的骨細胞功能的改變，可能是微重力影響骨重建的是始動因素。Aguirre 等[41]研究發現，尾吊后肢去負荷小鼠骨小梁和皮質骨中的骨細胞凋亡率增加，且凋亡的骨細胞主要分布在骨內膜的皮質骨部位，即骨吸收發生的部位，提示骨細胞的凋亡可能是啟動破骨細胞進行骨吸收的重要刺激。此外，模擬微重力可導致骨細胞(MLOY-4)中連接蛋白Wnt 通路下游靶基因Cycling D1 的mRNA 和蛋白表達減少，Connexin43 生物功能被破壞，β-catenin 蛋白表達減少，均提示Wnt/β-catenin 信號通路活性明顯下降[42]。同時模擬微重力可使MLOY-4 小鼠骨細胞膜骨架spectrin 以及內質網膜上蛋白IP3R 位置分布發生變化，導致骨細胞鈣池操縱Ca2+通道(SOC 通道)活性降低[43]。

3 結語

微重力會影響骨重建的各個階段，促進骨吸收、抑制骨形成，造成機體骨質丟失。進一步研究闡明微重力影響骨重建的細胞和分子機制，探尋其關鍵通路和靶點，從而建立緩解微重力導致骨質丟失的方法，對于我國中長期載人航天任務及空間站的順利運行十分必要。然而目前仍有一些問題需要解決，如微重力影響骨組織中各細胞的始動因素及關鍵分子尚不十分明確，其次缺乏微重力環境下各種骨組織細胞相互作用的研究。