杜鵑蘭酮的制備方法研究

陳卓　譚李玉　楊月　烏雪娟　夏銳

摘????? 要：為了探究抗糖尿病性視網膜病變活性天然產物杜鵑蘭酮的制備工藝，本研究以市售可得的4-芐氧基-6-羥基-2，3-二甲氧基苯乙酮為原料，經縮合、氫化、芐基化及選擇性去甲基化等6步反應，以9.6%的總收率制備了杜鵑蘭酮。最后考察了選擇性去甲基化反應中反應溶劑、反應溫度對目標產物得率的影響。

關? 鍵? 詞：杜鵑蘭酮;選擇性去甲基化反應;高異黃酮

中圖分類號：R9; TQ463?? ???文獻標識碼： A?? ????文章編號： 1671-0460（2020）07-1265-04

Study on Preparation of Cremastranone

CHEN Zhuo， TAN Li-yu，YANG Yue， WU Xue-juan， XIA Rui

（Xian Medical University， Xian Shaanxi 710021， China）

Abstract： In order to explore the preparation process of cremastranone， a natural product of anti-diabetic retinopathy activity， cremastranone was prepared with 4-oxyoxanoe-6-hydroxy-2， 3-dioxybenzone as raw material via six-step reactions， such as condensation， hydrogenation， benzylation，selective demethylation and so on，and the total yield was 9.6%. The effect of reaction solvent and reaction temperature on the yield of the target product was also investigated in the selective demethylation reaction.

Key words： Cremastranone; Selective demethylation reaction; Homoisoflavonoids

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy， DR）是糖尿病最常見的微血管并發癥之一，最終可導致不可逆的視力喪失^[1]。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor， VEGF）是導致糖尿病視網膜微血管病變的關鍵因子^[2]，是臨床藥物治療糖尿病視網膜病變的主要靶點。

目前，針對VEGF通路的主要一線臨床治療藥物是抗VEGF單抗^[3]。然而，抗VEGF單抗球內注射治療在DR治療中仍存在著一系列顯著問題：首先，由于抗VEGF單抗是分子量148 KD的蛋白質大分子，無法經角膜或血-視網膜屏障吸收入眼，必須通過玻璃體腔注射。反復的玻璃體腔注射破壞玻璃體的正常微環境^[4]，不僅給患者帶來極大的痛苦，也增加了對眼球組織的結構損害，臨床多見眼內感染、晶狀體損傷、高眼壓、動脈阻塞、結膜出血、玻璃體內浮游物等。第二，非選擇性的VEGF抑制可能導致視網膜正常組織結構的萎縮^[5]。視網膜的多種VEGF分泌細胞中，只有視網膜微血管內皮細胞產生的VEGF在DR的發展中是病理性的。而視網膜色素上皮細胞 （retinal pigment epithelium， RPE） 產生的生理性VEGF有助于維持脈絡膜微循環的正常生理狀態。VEGF單抗的非選擇性可能引起殘余正常視網膜神經細胞的凋亡變性，并且增加了脈絡膜毛細血管循環障礙的危險^[6]。第三，抗VEGF單抗制備、純化困難，生產成本高，導致價格昂貴，許多患者因而放棄治療。

因此，開發基于易制備的小分子化合物、具有高度選擇性的VEGF通路拮抗劑，如VEGF受體抑制劑，是目前的新藥研究及開發的熱點。杜鵑蘭酮（Cremastranone，結構如圖1）是一種天然產物，屬于3-苯基-4-色滿酮（chromanone），或高異黃酮（homoisoflavanone），于1987年在葡萄風信子（Muscari armeniacum）中首次發現^[7]，近年來在我國常見植物杜鵑蘭（Cremastra appendiculata （D.Don） Makino）中亦有發現^[8]，杜鵑蘭的假鱗莖入藥稱毛慈菇，錄于《本草拾遺》。

體內研究發現，杜鵑蘭酮具有顯著的新生血管抑制作用，對眼部微血管上皮細胞具有較強的選擇性抑制作用，但對眼部的其他細胞系，甚至大血管上皮細胞并未觀察到脫靶作用^[9]。在小鼠視網膜病變模型研究中具有良好的新生血管抑制作用，也未觀察到明顯的副作用^[10]。因此，對杜鵑蘭酮類結構進行深入研究，有望解決上述藥物所面臨的問題。

杜鵑蘭酮屬于二甲基取代的高異黃酮類化合物，其母核上的5個羥基中僅有兩個被甲基取代，在合成過程中實現選擇性甲基化/去甲基化具有顯著的挑戰性。目前，國內外對杜鵑蘭酮類結構的研究較少^[11-13]，本研究對其制備方法^[11]進行了考察（圖2），尤其針對其選擇性去甲基化反應進行了工藝改進。對于針對此類結構的深入研究及構效關系分析有著重要的基礎意義，此工藝研究目前未見文獻報道。

1? 儀器與試劑

磁力攪拌低溫槽，PSL-1810型，日本東京理化株式會社;Agilent TM 1260 型高效液相色譜儀。

4-芐氧基-6-羥基-2，3-二甲氧基苯乙酮， 95%，上海隆盛化工有限公司;異香草醛，98%，Macklin Inc.;鈀碳，10%Pd，Macklin Inc.;N，N-二甲基甲酰胺二甲縮醛，97%，Macklin Inc.;三甲基碘硅烷，97%，含銅作穩定劑，Macklin Inc.;芐溴，化學純，安耐吉化學;柱層析所使用薄層硅膠為硅膠H，青島海洋化工;其他常見有機溶劑、試劑均為分析純，必要時干燥。

2? 杜鵑蘭酮的制備研究^[11]

2.1? 4'-芐氧基-2'，3'，4-三甲氧基-6'，3-二羥基查爾酮（化合物1）的合成研究

稱取4-芐氧基-6-羥基-2，3-二甲氧基苯乙酮 3 g加至事先裝有溫度計及恒壓滴液漏斗的三頸瓶中，向三頸瓶中用量筒加入 30 mL 無水乙醇，攪拌至完全溶解。稱取事先無水處理過的KOH 0.67 g，攪拌混勻。稱取異香草醛 1.6 g，以40 mL無水乙醇溶解后，通過恒壓滴液漏斗緩緩滴加至反應液中， 滴加完畢通入氮氣保護，加熱攪拌至回流開始計時，反應12 h。 反應結束后，靜置冷卻至室溫。濾去不溶物，濾液減壓濃縮至約20 mL左右，抽濾，濾餅用10 mL無水乙醇洗滌，濾液繼續濃縮至干。所得油狀物用乙酸乙酯溶解，依次用5%鹽酸、飽和食鹽水洗滌，干燥，蒸干。所得黑色油狀物以硅膠柱層析法（環己烷∶乙酸乙酯3∶1至1∶1）純化，得到產物黃色油狀物2.02 g，產率46.3%，經核磁共振波譜法驗證為4'-芐氧基-2'，3'，4-三甲氧基-6'，3-二羥基查爾酮（化合物1），¹H-NMR （400 MHz， CD₃OD） δ 8.07 （s， 1H），7.21～7.43 （m， 9H），6.29 （s， 1H）， 5.19 （s， 1H），3.81 （d， 6H），3.74 （s， 3H）。

2.2 ?2'，3'，4-三甲氧基-4'，6'，3-三羥基二氫查爾酮（化合物2）的合成向100 mL 厚壁圓底燒瓶中依次加入化合物

1 1.09 g，鈀碳0.7 g，無水乙醇30 mL，安裝三通換氣閥。以氮氣置換體系中的空氣3次后，檢漏。以配置減壓閥的氫氣瓶將體系內氮氣置換為氫氣，最終維持在約0.1 MPa的內壓下，室溫下攪拌反應4 h。反應完畢后，將反應液小心地常壓過濾以回收鈀碳，濾餅用30 mL無水乙醇分多次洗滌，濾液濃縮至干。所得紅棕色膠狀物以硅膠柱層析法（環己烷∶乙酸乙酯3∶1至1∶1）純化，得到產物黃色油狀物0.65 g，產率74.9%，經核磁共振波譜法驗證為4'，3-二芐氧基-2'，3'，4-三甲氧基-6'-羥基二氫查爾酮（化合物3），¹H-NMR （400 MHz， CD₃OD） δ 9.62 （br， 1H），6.72 （s， 1H），6.59 （s， 2H），6.07 （s， 1H），3.88 （s， 3H），3.86 （s， 3H），3.61 （s， 3H），2.61 （t， 2H），2.52 （t， 2H）。

2.3? 4'，3-二芐氧基-2'，3'，4-三甲氧基-6'-羥基二氫查爾酮（化合物3）的合成

向裝有溫度計及恒壓滴液漏斗的三頸瓶中加入0.7 g化合物2及碳酸鉀0.83 g，丙酮30 mL。將此反應裝置置于磁力攪拌低溫槽中，低溫槽溫度設為-3 ℃。攪拌均勻后，從恒壓滴液漏斗中滴加0.82 g芐溴。滴畢，轉移至室溫下攪拌2 h，升溫至回流反應2 h。反應結束后，靜置冷卻至室溫，倒入水中以去除芐溴。將該混合物減壓蒸去丙酮，以乙酸乙酯50 mL分3次提取殘余水溶液，乙酸乙酯層合并后依次用飽和碳酸鈉溶液、飽和食鹽水洗滌，干燥，蒸干。所得黑色油狀物以硅膠柱層析法（環己烷∶乙酸乙酯10∶1至2∶1）純化，得到產物褐色固體0.75 g，產率71.4%，經薄層色譜法初步證實后，用于下步反應。

2.4 ?5，6，4'-三甲氧基-7，3'-羥基二氫高異黃酮（化合物4）的合成

向50 mL 厚壁圓底燒瓶中依次加入0.53 g化合物3，0.24 g DMF-DMA，甲苯30 mL，攪拌溶解后，安裝冷凝管，加熱至回流反應6 h。

冷卻至室溫后，向體系投入鈀碳0.2 g，安裝三通換氣閥。以氮氣置換體系中的空氣3次后，檢漏。以配置減壓閥的氫氣瓶將體系內氮氣置換為氫氣，最終維持在約0.1 MPa的內壓下，室溫下攪拌反應2 h。反應完畢后，將反應液小心地常壓過濾以回收鈀碳，濾餅用30 mL甲苯分多次洗滌，濾液濃縮至干。所得紅棕色膠狀物以硅膠柱層析法（環己烷∶乙酸乙酯1∶1）純化，得到產物黃色油狀物198 mg，產率54.9%。經核磁共振波譜法驗證為化合物4，¹H-NMR （400 MHz，CD₃OD） δ 6.79 （d， J =9.6Hz，1H），6.69 （s，1H），6.66 （dd，1H），6.21 （s，1H），4.34 （dd，J=7.6， 2.8Hz，1H），4.19 （dd，J=7.6，2.4 Hz，1H），3.77 （s， 3H）， 3.75 （s， 3H），3.62 （s， 3H），2.93 （dd，J=8.6，2.3Hz，1H），2.67 （m，1H），2.51 （dd，J =9.6，7.2Hz，1H）。

2.5 ?杜鵑蘭酮的合成

將72 mg化合物4加入10 mL圓底燒瓶中，加入氯仿2 mL，攪拌溶解，將此反應裝置置于磁力攪拌低溫槽中，低溫槽溫度設為-10 ℃。于攪拌下向反應液中滴入碘代三甲硅烷 90 mg的4 mL氯仿溶液。滴畢，保持在低溫槽中攪拌10 min，然后將反應體系溫度上升到室溫反應1 h，薄層色譜法監控反應，待反應結束后，將反應液倒入10 mL甲醇中。減壓蒸餾，剩余物以30 mL氯仿溶解后，分別用亞硫酸氫鈉水溶液和飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，飽和食鹽水洗滌，干燥，蒸干。所得黑色油狀物以硅膠柱層析法（環己烷∶乙酸乙酯2∶1至1∶1）純化，得到產物褐色固體48.6 mg，產率70.3%。經核磁共振波譜法驗證為目標產物杜鵑蘭酮，¹H-NMR （400 MHz， CD₃OD）δ 7.02 （d， J =5.8 Hz，1H），6.87 （s，1H），6.64 （m， 1H），5.89 （s， 1H），4.47 （dd， J=7.6，2.8 Hz，1H），4.11 （dd， J=7.6，4.8 Hz，1H），4.01 （s， 3H）， 3.93 （s， 3H），3.14 （dd， J=9.2，3.2 Hz， 1H），2.78 （m， 1H），2.50 （dd， J=9.2，3.2 Hz ，1H）。

3? 杜鵑蘭酮制備中選擇性去甲基化工藝探索

在杜鵑蘭酮的合成中，其7位羥基可以通過芐基進行保護，并在制備過程中通過氫化反應脫去芐基。然而，5位羥基從起始原料4-芐氧基-6-羥基-2，3-二甲氧基苯乙酮開始，在制備過程中始終被甲基保護，最終如何在不影響6，4'位的兩個甲氧基的情況下，選擇性地斷開醚鍵，脫去5位羥基上的甲基，是杜鵑蘭酮制備過程中的重要科學問題。

筆者考察了在該選擇性去甲基化反應中反應溶劑、反應溫度對目標產物得率的影響。

考察反應溶劑對選擇性去甲基化反應收率的影響時，考察了質子溶劑、非質子極性溶劑、中等極性溶劑及低極性溶劑等體系，考察結果如表1、表2。

考察反應溫度對選擇性去甲基化反應收率的影響時，采用氯仿為溶劑，考察結果如下。

從表1及表2中可以看出， 化合物4的最佳選擇性去甲基化反應條件為以氯仿為溶劑，室溫下反應。

4? 結束語

本研究以碘代三甲硅烷作為去甲基化試劑，在溫和的條件下實現了杜鵑蘭酮5位的選擇性去甲基化。該選擇性的實現，可能是由于該甲氧基旁邊4，6位的羰基和甲氧基的位阻效應，迫使該甲氧基略離開了苯環平面，使該甲氧基的氧原子無法與苯環共軛，氧無法接受苯環電子云的共軛效應，電負性增加，從而易接受親電進攻。在研究中，我們考察反應溫度時發現，在較高溫度下難以實現更高的收率，可能是因為在較高的溫度下，其他甲氧基上氧原子的反應活性提高了，難以實現區域選擇性的緣故。

本研究發現，去甲基化反應的最適合溶劑為氯仿，采用其他質子溶劑、非質子極性溶劑、低極性溶劑均無法獲得較好的結果。這可能是因為該反應機理為先生成離子化的碘化鎓鹽中間體，該鎓鹽再生成硅氧烷中間體，這一步反應為較慢的限速步驟。因此，可以合理推測^[14-15]，在極性溶劑中鎓鹽得到了較好的溶劑化，使其參與的反應的活化能壘提高，不利于反應的進行。當使用低極性的甲苯作為溶劑時，收率降低可能是因為鎓鹽中間體的溶解性問題或區域選擇性較差導致的，該原因有待在后續研究中進一步探討。

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基金項目：陜西省教育廳專項科研計劃項目（項目編號：19JK0772）;西安醫學院大學生創新創業訓練計劃項目（項目編號：2018DC-32，

2018DC-75）。

收稿日期：2020-04-04

作者簡介：陳卓，男，副教授，研究方向：新藥開發。E-mail：chenzhuo_chem@outlook.com。