沙坡頭地區地衣和蘚類結皮叢枝菌根真菌多樣性研究*

漆婧華劉玉冰?李新榮趙麗娜張雯莉王巖松

沙坡頭地區地衣和蘚類結皮叢枝菌根真菌多樣性研究*

漆婧華1，2，劉玉冰1?，李新榮1，趙麗娜1，2，張雯莉1，2，王巖松1，2

（1. 中國科學院西北生態環境資源研究院，沙坡頭沙漠試驗研究站，蘭州 730000；2. 中國科學院大學，北京 100049）

叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是自然界分布最廣的一類植物共生真菌，可與生物土壤結皮（Biological soil crust，BSC）的隱花植物形成共生體，對荒漠植被的恢復和演替具有重要意義。目前針對不同類型BSC的AMF群落結構及其多樣性研究較少，限制了AMF群落對BSC發育的作用和對荒漠生態系統貢獻的理解。利用高通量測序技術，對騰格里沙漠東南緣沙坡頭固沙植被區地衣和蘚類結皮及其下層土壤AMF群落組成與多樣性進行研究，分析不同結皮類型AMF群落結構的差異。結果發現，AMF群落豐富度和多樣性表現為：蘚類結皮下層土壤>地衣結皮下層土壤>蘚類結皮>地衣結皮。地衣和蘚類結皮及其下層土壤AMF均屬于球囊菌門、球囊菌綱，以球囊霉屬、類球囊霉屬、盾巨孢囊霉屬、巨孢囊霉屬和一種未分類屬為優勢，且地衣和蘚類結皮AMF群落在屬水平差異顯著。主成分分析結果顯示，蘚類結皮下層土壤中AMF群落物種組成與其他各組有顯著差異，表明隨著結皮的發育，AMF群落多樣性增加，結皮演替與AMF群落多樣性之間具有相互促進的作用。

生物土壤結皮；叢枝菌根真菌；高通量測序技術；群落結構和多樣性

荒漠生態系統是全球陸地生態系統的重要組成部分。在荒漠生態系統中，生物土壤結皮（Biological soil crust，BSC）占荒漠生態系統活體蓋度的40%～70%。BSC是指隱花植物與土壤中的細菌、真菌等微小生物通過與土壤顆粒“膠結”形成的荒漠地表的一種生物覆蓋體[1]。作為寒區、旱區嚴酷荒漠生境地表組成和景觀的重要特征[1]，BSC扮演了“生態系統工程師”的重要角色，能夠有效地改善地表微生境，對荒漠生態系統的能流、物流、養分循環以及維管束植物的萌發、定居和繁衍等具有重要作用[2]。

叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是陸地生態系統最重要的土壤微生物之一，能與約80%的陸生高等植物根系形成寄生—共生統一體[3]。AMF從宿主植物獲得碳水化合物，同時幫助其吸收水分和養分，促進植物的生長，提高植物對干旱、鹽漬、重金屬以及極端溫度的耐受性[4-5]。AMF主導的菌根共生系統已成為應對全球變化的一種新型生物修復主體[6-7]。從生物進化的角度看，荒漠植物與AMF建立共生關系是適應水分和資源極度匱乏的荒漠生態系統雙贏的重要生存策略[8]。

國內外對于荒漠生態系統AMF群落多樣性已經進行了大量研究[9-11]，在荒漠生境中已發現AMF寄主植物69科389種，AMF7屬89種，且有新種不斷出現[12]。菌根真菌與隱花植物共生的最早報道是在花斑煙桿蘚（）的孢蒴中發現了真菌菌絲[13]。近年來有關培養的AMF和苔蘚植物共生的研究也越來越多，尤其Schü?ler[14]在試管中培養與角苔（）后使得該種研究更加深入。但關于荒漠生態系統重要組成部分BSC層AMF物種的多樣性鮮有報道。最近，Hernández-Hernández等[15]提出AMF存在于BSC層，并認為AMF在養分匱乏和水分虧缺的荒漠生態系統中扮演著重要角色。然而，由于受到所研究BSC類型的限制，并沒有考慮到BSC可能作為AMF的寄主植物。那么，BSC類型的變化是否會影響荒漠生態系統中AMF聯合體的群落特征呢？本研究以騰格里沙漠東南緣固沙植被區典型地衣和蘚類結皮及其下層土壤為對象，利用Illumina MiSeq測序技術研究地衣和蘚類結皮中AMF群落結構組成和多樣性，分析地衣和蘚類結皮對AMF群落結構多樣性的影響，以期探明結皮的演替與AMF群落多樣性之間的關系。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

試驗區位于騰格里沙漠東南緣中國科學院沙坡頭沙漠研究試驗站的人工固沙植被區（37°32′ N，105°02′ E）。沙坡頭人工固沙植被區始建于1956年，人工植被的建立使生態環境得到改善，表面的流沙得到固定，在固定的沙面上逐步形成包括藻類（algae）結皮、地衣（lichen）結皮、蘚類（moss）結皮以及過渡混生結皮[1]的研究干旱區生態恢復的以空間代替時間的經典演替序列。該區屬干旱、半干旱氣候過渡區，海拔1 250 m，年均溫9.6℃，最高溫38.1℃，最低溫–25.1℃，年均降水量186.2 mm（1956—2012年），70%的降水主要集中在6—9月，年潛在蒸發量為2 300～2 500 mm，主要集中在生長季（5—9月）。目前，該區人工植被主要物種有花棒（）、檸條（）、油蒿（）、小畫眉草（）等。

1.2 樣品采集

以研究區分布最廣泛的地衣和蘚類結皮及其下層土壤為研究對象，選取相對均質且發育完好的實驗區。在實驗區內選取10 m′10 m的大樣方，再在大樣方內隨機選取3個0.1 m′0.1 m的小樣方，按照“五點混合法”進行采樣。采樣時用無菌手術刀垂直切取完整的BSC層樣品及BSC下層土壤（0～5 cm），迅速放入4℃的保溫箱中帶回實驗室。樣品命名為：LB：地衣結皮；MB：蘚類結皮；LBS：地衣結皮下層土壤；MBS：蘚類結皮下層土壤。所有樣品過2mm篩去除大顆粒和植物根后保存于–80℃，用于群落結構的分子生物學分析。

1.3 DNA提取和PCR擴增

采用試劑盒Fast DNA? SPIN Kit for Soil（QBIOgene Inc.，Carlsbad，CA，USA）提取樣品DNA。參考Stockinger[16]和Krüger[17]等的方法，選用AML1/AML2為第一對引物[18]，AMV4.5NF/ AMDGR[19]為第二對引物，采用巢式PCR的方法擴增18S rDNA片段。擴增得到的PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，利用Illumina MiSeq測序技術對樣品進行測序（Illumina MiSeq測序委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成）。

1.4 生物信息學及統計學分析

使用FLASH、Trimmomatic軟件對原始序列進行數據去雜和質控過濾，得到優化數據。利用上海美吉生物醫藥科技有限公司I-sanger云平臺提供的數據處理軟件進行數據處理分析。基于Usearch軟件平臺對得到的高質量序列按照97%的相似度進行操作分類單元（Operational taxonomic units，OTU）的聚類，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，比對數據庫為Silva的真菌18S rRNA數據庫。基于OTU聚類和注釋的結果，利用R語言工具繪制稀釋性曲線、Venn圖和群落組成分析圖，并通過mothur指數分析軟件進行Alpha（α）多樣性指數的計算。其他數據分析和作圖利用SPSS 22.0和Origin 9.0軟件完成。

2 結 果

2.1 測序樣本的質量檢測和稀釋性曲線

通過Miseq平臺對4組樣品進行測序，共獲得176 175條原始序列，經數據去雜后獲得132 636條優化序列，97%相似水平下聚類分析后共獲得56個AMF操作分類單元（OTU）。對測序樣品中的序列進行隨機抽樣，以測序數據量為橫坐標，各測序量下微生物多樣性指數（香農指數）大小為縱坐標獲得稀釋性曲線如圖1所示。從圖中可以看出，當測序量達到200條左右時曲線趨于平坦，香農指數不再增加，說明測序數據量足夠大，可以充分反映樣本中絕大多數的微生物多樣性信息。

注：LB、MB、LBS、MBS分別代表地衣結皮、蘚類結皮、地衣結皮下層土壤和蘚類結皮下層土壤；下同。Note：The letters LB，MB，LBS and MBS stands for lichen crusts，moss crusts，underlying soils of lichen crusts and underlying soils of moss crusts，respectively. The same below.

統計地衣、蘚類結皮及其下層土壤中共有和特有的OTU數目，選用相似水平為97%的OTU樣品表畫出維恩圖，如圖2所示。LB、MB、LBS、MBS樣品分別有23、18、26和22個OTUs，各組特有OTU數目分別為11、6、7和12個，MBS樣品中特有OTU數目占到所有OTU數目的54.5%。兩兩比較共有OTU數目，依次排序為：LB與LBS組（12個）、LBS與MB組（11個）、LB與MB組（9個）、LBS與MBS組（9個）、MB與MBS組（5個）、LB與MBS組（4個）。其中LB與LBS組共有的OTU數目最多，占到總OTU數的21.43%；LB與MBS組共有的OTU數目最少，占總OTU數的7.14%。所有樣品共同包含的OTU數目僅為4個，占總OTU數目的7.14%。說明不同樣品中含有相同物種，但占比較小；地衣結皮與地衣結皮下層土壤AMF群落物種組成最為相似，地衣和蘚類結皮下層土壤之間AMF群落物種組成差別最大。

2.2 AMF群落多樣性

地衣、蘚類結皮及其下層土壤AMF群落多樣性指數如表1所示，群落豐富度和多樣性指數均表現出蘚類結皮下層土壤高于地衣結皮下層土壤高于蘚類結皮高于地衣結皮的變化趨勢。說明AMF群落豐富度和多樣性指數蘚類結皮下層土壤最大，地衣結皮最小，且蘚類結皮下層土壤AMF群落多樣性與其他各組有顯著差異；且結皮下層土壤高于結皮層，蘚類結皮高于地衣結皮。

表1 地衣、蘚類結皮及其下層土壤AMF群落豐富度與多樣性指數

注：平均值±標準誤差，=3，不同字母表示在<0.05水平下有顯著差異。Note：Means±standard error，=3. Different letters indicate significant difference at 0.05 level.

2.3 AMF群落組成

群落組成分析結果表明，樣本中檢測到的OTUs分屬于球囊菌門、球囊菌綱的4目、5科、6屬。在目分類水平上（圖3a），除只能分類到球囊菌綱的物種外，按照相對豐度大小排序依次為：球囊霉目（Glomerales，6.69%～99.99%）、類球囊霉目（Paraglomerales，0～20.91%）和多樣孢囊霉目（Diversisporales，25.22%）。

圖3 地衣、蘚類結皮及其下層土壤目（a）、科（b）和屬（c）分類水平上AMF群落組成

科分類水平的AMF群落組成如圖3b所示，按照相對豐度大小依次為：只能分類到球囊菌綱的物種（f_unclassified_c_Glomeromycetes，6.69%～99.99%）和球囊霉科（Glomeraceae，0.01%～47.18%）、類球囊霉科（Paraglomeraceae，0.01%～20.91%）、巨孢囊霉科（Gigasporaceae，0～21.10%）、多樣孢囊霉科（Diversisporaceae，0～4.13%）物種。其中球囊霉目進一步分類為球囊霉科；類球囊霉目分類為類球囊霉科；蘚類結皮下層土壤中多樣孢囊霉目分類為巨孢囊霉科和多樣孢囊霉科。

在屬分類水平（圖3c），AMF群落按照相對豐度大小依次為：只分類到綱的球囊菌綱物種（g_unclassified_c_Glomeromycetes，6.69%～99.99%）和分類到屬的球囊霉屬（，19.55%～47.18%）、類球囊霉屬（，0.01%～20.91%）、盾巨孢囊霉屬（，13.37%）、巨孢囊霉屬（，7.72%）以及只能分類到科的多樣孢囊霉科物種（g_unclassified_ f_Diversisporaceae，4.13%）。其中，球囊霉科分類為球囊霉屬，類球囊霉科分類為類球囊霉屬，蘚類結皮下層土壤中巨孢囊霉科進一步分類為盾巨孢囊霉屬和巨孢囊霉屬。

2.4 不同BSC對AMF屬水平物種豐度的影響

圖4為地衣、蘚類結皮及其下層土壤中AMF屬水平的物種相對豐度圖。從圖中可以看出，地衣結皮中AMF主要由僅能分類到球囊菌綱的物種（占到99.99%）組成，極少部分分類到球囊霉屬（僅占0.01%）和類球囊霉屬（少于0.01%）；蘚類結皮主要由未能分類到屬的球囊菌綱物種（66.48%）和球囊霉屬（33.52%）物種組成；地衣結皮下層土壤主要由未能分類到屬的球囊菌綱物種（74.29%）和分類到屬的球囊霉屬（19.55%）、類球囊霉屬（6.16%）物種組成；蘚類結皮下層土壤由未能分類到屬的球囊菌綱（6.69%）、多樣孢囊霉科（4.13%）物種和分類到屬的球囊霉屬（47.18%）、類球囊霉屬（20.91%）、盾巨孢囊霉屬（13.37%）、巨孢囊霉屬（7.72%）物種組成。其中蘚類結皮下層土壤中僅能分類到球囊菌綱的物種顯著降低（<0.05），而類球囊霉屬的物種顯著增加（<0.05）。

注：圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著（P<0.05）。Note：Different letters indicate significant difference at 0.05 level.

分析可知，地衣結皮和地衣結皮下層土壤中AMF物種完全相同，只是相對豐度不同。與地衣結皮及其下層土壤相比，蘚類結皮中僅存在未能分類到屬的球囊菌綱物種和球囊霉屬物種，未發現類球囊霉屬的物種。蘚類結皮下層土壤中除出現了其他3個樣品中所有物種外，還出現了未能分類到屬的多樣孢囊霉科物種和分類到屬的類球囊霉屬、盾巨孢囊霉屬、巨孢囊霉屬物種。未能分類到屬的球囊菌綱物種和球囊霉屬物種在四種樣品中同時存在，只是相對豐度不同，說明未能分類到屬的球囊菌綱物種和球囊霉屬物種屬于該區生物土壤結皮區的優勢菌群。未能分類到屬的球囊菌綱物種在蘚類結皮下層土壤中顯著降低；類球囊霉屬物種在地衣結皮下層土壤和蘚類結皮下層土壤中出現且二者之間差異不顯著，但與地衣結皮和蘚類結皮有顯著差異，說明類球囊霉屬可能是周圍環境中植物共生菌。主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）如圖5所示，前兩軸解釋了76%的群落變異，蘚類結皮下層土壤AMF群落與其他各組相比位置發生了明顯的變化，說明蘚類結皮下層土壤AMF群落組成與其他各組有顯著的差異。

圖5 地衣、蘚類結皮及其下層土壤AMF群落主成分分析

3 討 論

AMF專性共生的特性是傳統微生物生態學研究的最大障礙。近年來，隨著分子生物學技術和新一代測序技術的快速發展和應用，使得AMF的研究更加全面和準確。包美麗[9]的研究發現，鄂爾多斯沙地生物土壤結皮AMF種類優勢菌屬為球囊霉屬、無梗囊霉屬（）、多孢囊霉屬和盾巨孢囊霉屬。包玉英[20]通過對內蒙古典型荒漠群落AMF種類的研究發現，球囊霉屬種類、頻度最高，球囊霉屬和無梗囊霉屬是該區的優勢屬，其次為巨孢囊霉屬和盾巨孢囊霉屬。Wang等[21]對毛烏素沙漠AMF群落結構和多樣性的研究發現，來自不同土壤深度和植物的AMF屬的組成中，球囊霉屬、無梗囊霉屬和盾巨孢囊霉屬占總數的70%以上，多樣孢囊霉屬和巨孢囊霉屬僅在淺層土壤中發現。我們對騰格里沙漠東南緣沙坡頭地區地衣和蘚類結皮及其下層土壤AMF群落的研究結果與前人基本一致，主要由未能分類到屬的球囊菌綱物種、多樣孢囊霉科物種和分類到屬的球囊霉屬、類球囊霉屬、盾巨孢囊霉屬和巨孢囊霉屬物種組成。其中，未能分類到屬的球囊菌綱物種和球囊霉屬物種屬于優勢菌群。鄂爾多斯沙地、內蒙古典型荒漠以及毛烏素沙漠AMF群落中均出現了無梗囊霉屬物種，但本研究結果中未發現。已有研究表明[20，22]，AMF多樣性及分布不僅與海拔及氣候因子中年降水量、年均溫顯著相關，還與土壤pH、有機質及N、P含量等顯著相關。包玉英和閆偉[23]對蒙古韭（）共生真菌及其菌根形態學的研究表明，沙坡頭地區AMF優勢種與其他沙地有較大差異。此外，有研究表明[24]宿主植物也會影響AMF的多樣性。所以推測一方面可能與所研究的宿主植物不同有關，另一方面未分類到屬的球囊菌綱物種中可能存在該地區特有的無梗囊霉屬新物種，未能和已有無梗囊霉屬物種序列庫進行比對，需要通過其他鑒定方法進一步確定。

球囊霉屬物種同時出現在蘚類結皮、地衣結皮下層土壤和蘚類結皮下層土壤中；與結皮層相比，地衣和蘚類結皮下層土壤中出現了類球囊霉屬物種，而巨孢囊霉科的盾巨孢囊霉屬、巨孢囊霉屬和只能分類到科水平的多孢囊霉科物種僅在蘚類結皮下層土壤中出現。說明球囊霉屬的物種可能是蘚類植物共生菌屬，地衣結皮下層土壤中球囊霉屬物種可能來源于周圍環境。類球囊霉屬物種僅在地衣結皮下層土壤和蘚類結皮下層土壤中出現，推測該物種很有可能屬于該區周圍環境中植物共生菌，還需要通過對周圍環境中植物共生AMF進一步研究從而找到其具體來源。盾巨孢囊霉屬、巨孢囊霉屬和只能分類到科的多樣孢囊霉科物種僅在蘚類結皮下層土壤中出現，推測這幾種物種很有可能也屬于蘚類植物共生菌，對于在蘚類結皮中未發現的原因還需要進一步探究。

本研究AMF群落豐富度和多樣性結果表現為蘚類結皮下層土壤高于地衣結皮下層土壤高于蘚類結皮高于地衣結皮。結皮下層土壤AMF群落豐富度和多樣性高于結皮層土壤，這與前人的研究結果一致[9]。BSC形成的早期階段，隨著土壤微生物在沙土表面的生長，逐漸形成以藻類植物為主體的藻結皮[1]。藻類植物的定居，使得土壤微環境得到有效的改善，地衣植物開始在此定植。藻類和地衣植物使得沙土結構得以改善，當土壤表面得到一定固定后，開始形成以地衣和苔蘚植物為優勢的生物結皮類型[25-29]。相對干燥、穩定的地表景觀形成多以地衣為主的BSC[1，30-31]，相對潮濕的局部土表或有利于集結雨水以及能產生凝結水的微地形有利于蘚類結皮的拓殖和繁衍，這些部位被蘚類為優勢種的BSC所替代[1]。此外，物種組成分析結果表明，蘚類結皮下層土壤中包括了地衣結皮、蘚類結皮以及地衣結皮下層土壤中出現的所有物種；PCA分析結果表明，蘚類結皮下層土壤中AMF群落與其他各組有顯著差異。物種組成分析與PCA分析結果一致。說明隨著BSC的發育演替，土壤環境得到了逐步改善，AMF群落多樣性逐漸增加。同時，由于AMF與植物的共生，有效地改善了微生境，提高了植物對惡劣環境的適應，反過來可以促進BSC的發育，從而加速荒漠生態系統的恢復。

4 結 論

沙坡頭地區地衣和蘚類結皮中共鑒定出AMF 4目、5科、6屬。其中，屬為優勢種，其次為和屬的真菌種類，而屬的種類較少。不同土層中分布的AMF種類有一定的差異，蘚類結皮下層土壤中包括了地衣結皮、地衣結皮下層土壤及蘚類結皮中出現的所有AMF種類。結皮的發育與AMF群落多樣性之間有明顯的相互促進作用，AMF群落多樣性結皮下層土壤高于結皮層，蘚類結皮高于地衣結皮，且蘚類結皮下層土壤顯著高于其他各組。

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AMF Diversity Analysis of Lichen and Moss Biocrusts in Shapotou Region

QI Jinghua1, 2, LIU Yubing1?, LI Xinrong1, ZHAO Lina1, 2, ZHANG Wenli1, 2, WANG Yansong1, 2

(1. Shapotou Desert Research and Experimental Station, Northwest Institute of Eco-environment and Resource, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

【】Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) are one of the most widely distributed plant symbiotic fungi in nature. They can form symbiont with cryptogam in biological soil crust (BSC), which is of great significance to the restoration and succession of desert vegetation. However, there are few studies on AMF community structure and diversity in different BSCs types, which limited the understanding of the roles of AMF community in the development of BSCs and its contribution to desert ecosystems. So, will the changes of BSC type affect the community characteristics of AMF complexes in desert ecosystems? 【】 In view of the problems mentioned above, this study was based on enclosed revegetation sites in the southeast fridge of the Tengger Desert located at the Shapotou Desert Research &Experiment Station, with the lichen and moss crusts and their underlying soils as the research object. We used high-throughput sequencing technologies studied the AMF community structure composition and diversity of lichen, moss crusts and their underlying soils, and to determine whether different BSCs types will cause differences in AMF community characteristics. 【】 The following results were obtained. AMF community richness and diversity index of the underlying soils of moss crusts were the largest and the underlying soils of lichen crusts were the smallest. The AMF community diversity of the underlying soils of moss crusts is significantly different from other groups. The richness and diversity of AMF community of underlying soils were higher than crusts layers, and moss crusts was higher than lichen cursts. The AMF in the lichen and moss crusts and their underlying soils consisted by Glomeromycetes, Glomeromycota. At the genus level, one unclassified species(g_unclassified_c_Glomeromycetes, 6.69%-99.99%)and(19.55%-47.18%),(0.01%-20.91%),(13.37%) and(7.72%) were the dominant species, and the species that could be classified into Diversisporaceae (g_unclassified_f_Diversisporaceae, 4.13%) were quite limited in percentage. The species of AMF community in the lichen crusts and their underlying soils were exactly the same in composition, but their relative abundance was different. Compared with lichen crusts and their underlying soils, only the species of Glomeromycetes andwere found in the moss crusts, and the species ofcould not be found. Except for species that appeared in the other samples, there were also found an unclassified Diversisporaceae species and,,in the underlying soils of moss crusts. The species of the unclassified Glomeromycota andwere coexisted in all samples, but the relative abundance was different, which indicates that they belonged to the dominant fungi in the BSCs of this area. The species ofwere found in the underlying soils of lichen and moss crusts, and the difference between them was not significant, but there were significant differences with lichen and moss crusts, which suggested thatmay be the plant symbiotic fungi in the surrounding environment. 【】 With the development of BSCs, the diversity of AMF community increased, and the succession of BSC and diversity of AMF communities can promote each other.

Biological soil crust; Arbuscular mycorrhizal fungi; Illumina MiSeq high-throughput sequencing technique; Community structure and diversity

Q938.1

A

10.11766/trxb201904190054

漆婧華，劉玉冰，李新榮，趙麗娜，張雯莉，王巖松. 沙坡頭地區地衣和蘚類結皮叢枝菌根真菌多樣性研究[J]. 土壤學報，2020，57（4）：986–994.

QI Jinghua，LIU Yubing，LI Xinrong，ZHAO Lina，ZHANG Wenli，WANG Yansong. AMF Diversity Analysis of Lichen and Moss Biocrusts in Shapotou Region[J]. Acta Pedologica Sinica，2020，57（4）：986–994.

* 國家自然科學基金項目（41977204）資助 Supported by the National Natural Science Foundation of China（No. 41977204）

，E-mail：liuyb@lzb.ac.cn

漆婧華（1990—），女，甘肅定西人，博士研究生，研究方向為微生物生態學。E-mail：qijinghua18@mails.ucas.ac.cn

2019–04–19；

2019–07–22；

2019–09–03

（責任編輯：盧 萍）