響應面優化火麻油及有氧運動對骨質疏松大鼠骨密度的影響

（鄭州工業應用技術學院，河南鄭州451199）

火麻，別稱山絲苗、線麻、胡麻、漢麻等。桑科，大麻屬一年生直立草本，在我國種植火麻的主要地方包括廣西、云南、甘肅等省份[1]。火麻油的營養成分，其中不飽和脂肪酸含量豐富，大約有89%左右，不飽和脂肪酸主要為油酸占9.6%～14.7%、亞油酸占52.2%～58.2%和亞麻酸占15.2%～23.9%[2-3]。火麻油中還含有氨基酸、維生素E、礦物質元素、不溶性纖維、甾體類、生物堿類、黃酮類和苷類等成分，所以營養價值非常豐富[4-5]。尤其火麻油含有豐富的礦物質元素，K、Mg、Ca、Na、Fe、Mn、Cu、Zn 等人體必需的礦物質，其中元素 K、Mg、Ca的含量特別高[6]。K是細胞內液的主要離子，Mg對機體心臟的調節起到重要作用，Ca是骨骼、牙齒及軟組織的重要成分，缺鈣易得佝僂病、骨質疏松癥、心血管病等[7]。

骨質疏松癥是一種以全身骨量減少、骨密度損失及骨組織微觀結構退化為特征，骨折危險性增大的全身代謝性疾病[8]。臨床以周身疼痛、身高降低、駝背、脆性骨折及呼吸系統受影響等為主要表現[9]。因此，改善骨質疏松主要就是減少骨量丟失，增加骨質形成，補充骨礦物質，提高骨密度。諸多研究表明，運動鍛煉有利于骨質健康，增加骨代謝，使骨形成較好的結構和強度。一旦運動不足會導致骨密度低下，增加患骨質疏松癥的風險[10-11]。

當前，對于火麻油的提取主要有肇立春等[12]利用冷榨法來提取火麻油，彭丹[13]等利用微波輔助來提取火麻油，曾凡炎等[14]利用超聲波與微波輔助來提取火麻油，以上幾種方法在提取火麻油中較為普遍。本文利用響應面優化溶劑法提取火麻油，以便為今后的工業生產提供更多的技術支持。由于火麻油的微量元素含量較為豐富，并且根據其Ca含量較高的特點，而且Ca是骨骼中重要組成部分，設計一個大鼠骨質疏松的模型，通過雌性大鼠摘除卵巢，使體內雌激素分泌減少，雌激素在機體內由于參與骨代謝，從而造成骨吸收增強，致使快速的骨丟失，考察火麻油對大鼠骨密度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

火麻仁：長春市方一堂經貿有限公司；石油醚：天津科密歐試劑有限公司；大鼠骨鈣素（OC）、磷（P）、雌二醇試劑盒：南京建成生物工程研究所；SPF級雌性SD大鼠50只 [體重在（150±5）g[SYXK（蘇）2018-0008）]：江蘇集萃藥康生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

KJ3000+骨密度儀：南京科進實業有限公司；RE-201D型旋轉蒸發儀：鄭州科文儀器設備有限公司；HZY-1202型天子天平：上海茂宏電子科技有限公司；DFT-100A型粉碎機：無錫久平儀器有限公司；BK-200型生化分析儀：山東博科生物產業有限公司；ZH-PT型動物實驗跑臺：安徽正華生物儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 火麻油的制備

選取火麻仁適量，將其粉碎至粒度為可以過100目篩。將之前處理好的火麻仁粉末稱取適量，放入圓底燒瓶中，加入一定量的石油醚，調節到設置的溫度、提取時間，進行提取，提取完成后，蒸發掉溶劑，干燥稱重，得到火麻油[13，15]。

式中：Y為火麻油得率，%；m火麻油質量，g；n火麻仁粉末質量，g。

1.3.2 單因素試驗

在提取溫度40℃、提取時間90 min，設定不同液料比為 6 ∶1、10 ∶1、14 ∶1、18 ∶1、22 ∶1（mL/g）；在液料比為 14 ∶1（mL/g）、提取時間 90 min，設定不同提取溫度分別為 30、35、40、45、50 ℃；在液料比為 14 ∶1（mL/g）、提取溫度40℃，設定不同提取時間分別為30、60、90、120、150 min，考察火麻油得率的影響。

1.3.3 響應面法優化火麻油提取工藝

在單因素試驗的基礎上，通過火麻油得率（Y）為指標，液料比（X1）、提取溫度（X2）和提取時間（X3）為因素，進行三因素三水平響應面試驗設計，采用Design-Expert 8.0軟件設計的Box-Behnken試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平Table 1 Box-Behnken test design factor level

1.3.4 動物模型、分組以及運動方案

模型設計：大鼠使用35 mg/kg戊巴比妥鈉經腹腔麻醉后，剃掉其毛發，在大鼠的脊柱兩側切開背肌大約1.5 cm切口，摘除卵巢。使用可以吸收的羊腸線縫合大鼠傷口，術后腹腔注射60×104U/kg青霉素鈉，1次/d，持續注射5 d，以防術后感染。大鼠全部存活并沒有出現感染癥狀[16]。

選取SPF級雌性SD大鼠50只，體重在（150±5）g，隨機分成5組，每個小組10只大鼠，分成對照組、模型組、運動組、火麻油組、火麻油運動組。其中對照組不進行手術，其余組以戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，摘除雙側卵巢。除了對照組、模型組、火麻油組，其余2組SD大鼠放置在動物跑臺上進行跑步訓練，第一周對大鼠進行跑步適應訓練，將跑臺參數設置成0度、10 m/min、45 min，使大鼠跑步訓練保持45 min；第二周開始將跑臺參數設置成7度、25 m/min，直至大鼠力竭。大鼠力竭的標準為，使用毛刷刺激大鼠尾部，大鼠在跑步過程中與跑臺預設速度出現不一致情況，其臀部壓在跑臺上，而且后肢與跑臺皮帶后拖達到20 s以上。火麻油組對其進行灌胃0.8 mg/g的火麻油；火麻油運動組在按照運動組進行跑步運動之外，每天對大鼠灌胃0.8 mg/g的火麻油，并觀察每天大鼠的變化，實驗持續6周[17-18]。

1.3.5 相關指標檢測

大鼠骨鈣素（OC）、磷（P）、雌二醇含量測定：各組大鼠麻醉后腹主動脈取血，分離血清，-25℃保存，根據酶學試劑盒的說明書檢測分析；骨密度測定：采用骨密度儀對大鼠腰椎骨進行檢查。

1.4 統計學分析

本文使用SPSS 18.0軟件進行數據分析，數據均使用均值±標準差來表示，采取組間進行對比，P＜0.05、P＜0.01表示具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 液料比對火麻油得率的影響

液料比對火麻油得率的影響見圖1。

圖1 液料比對火麻油得率的影響Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on the yield of hemp oil

由圖1分析，液料比的增加，使得火麻油的得率逐漸升高，在14∶1（mL/g）時得率達到最高，繼續增加液料比提取趨于不變。這是因為液料比的增加，使得火麻仁與提取溶劑之間接觸更加充分，提取逐漸提高。繼續增加液料比，火麻油得率反而趨于平衡，考慮到溶劑回收時間和成本的問題，因此液料比選擇14 ∶1（mL/g）。

2.1.2 提取溫度對火麻油得率的影響

提取溫度對火麻油得率的影響見圖2。

由圖2分析，提取溫度的增加，使得火麻油的得率逐漸升高，當溫度達到45℃時得率達到最高，繼續升高溫度，火麻油得率出現降低。因為溫度過高會導致火麻油中其他活性成分在溶劑中的濃度隨之提高，從而與火麻油形成競爭，導致得率降低，另外溫度過高會導致火麻油營養成分被破壞，降低了原有的生物活性。

圖2 提取溫度對火麻油得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of hemp oil

2.1.3 提取時間對火麻油得率的影響

提取時間對火麻油得率的影響見圖3。

圖3 提取時間對火麻油得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of hemp oil

由圖3分析，提取時間為90 min時，火麻油得率達到最高，時間繼續延長得率反而有所降低。這是由于90 min時，火麻油提取接近完全，從得率和節省時間等方面來分析，再繼續延長提取時間得率反而稍有降低，因此，選擇提取時間為90 min。

2.2 響應面法試驗結果與分析

在單因素試驗的基礎上，確定各因素最佳水平值范圍，采用響應面法試驗設計，以火麻油得率（Y）為指標，液料比（X1）、提取溫度（X2）和提取時間（X3）為因素，進行三因素三水平響應面試驗，設計Box-Benhnken試驗中心組合試驗。響應面分析方案與結果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計與結果Table 2 Box-Behnken test design and results

續表2 Box-Behnken試驗設計與結果Continue table 2 Box-Behnken test design and results

響應面回歸模型ANOVA分析結果見表3。

表3 響應面回歸模型ANOVA分析結果Table 3 Response surface regression model ANOVA analysis results

響應面分析方案與結果如表2，采用Design-Expert 8.0軟件對表3試驗數據進行多元回歸擬合，得到多元回歸方程：

Y=-82.18+3.37X1+1.44X2+1.91X3-0.70X1X2+0.26X1X3-0.25X2X3-3.88X12-3.99X22-2.14X32

由表3的ANVOA分析可知：模型P=0.000 1＜0.01極顯著，失擬項P=0.505 5＞0.05不顯著，說明方程對該試驗具有較好的擬合性，試驗誤差較小。相關系數R2=0.999 3，調整系數Adj.R2=0.998 3也表明上述模型擬合程度較好。該模型可用于提取火麻油。

對火麻油得率影響順序依次為：液料比（X1）＞提取時間（X3）＞ 提取溫度（X2）。并且液料比（X1）、提取溫度（X2）和提取時間（X3）影響都達到了極顯著水平（P＜0.01）；X1X2達到極顯著水平（P＜0.01）、X1X3達到顯著水平（P＜0.05）、X2X3達到顯著水平（P＜0.05）；液料比（X1）、提取溫度（X2）和提取時間（X3）各因素的二次項對得率影響極顯著（P＜0.01）。

2.3 響應面法分析最佳工藝方案

液料比與提取溫度對得率的影響見圖4。

圖4 液料比與提取溫度對得率的響應面分析Fig.4 Response surface analysis of the ratio of liquid to material and extraction temperature to the yield

液料比與提取時間對得率的影響見圖5。

圖5 液料比與提取時間對得率的響應面分析Fig.5 Response surface analysis of liquid-to-material ratio and extraction time to yield

提取溫度與提取時間對得率的影響見圖6。

圖6 提取溫度與提取時間對得率的響應面分析Fig.6 Response surface analysis of extraction temperature and time to yield

通過上述分析得火麻油最佳提取條件為：當液料比為16∶1（mL/g）、提取溫度為46℃、提取時間為104 min時，火麻油的得率為83.45%。選取上述組合做3次驗證試驗，得出火麻油的平均得率為83.39%。與預測值相近，證明該工藝可以用來提取火麻油。

2.4 火麻油結合運動對骨質疏松大鼠骨密度的影響

火麻油結合運動對骨質疏松大鼠骨密度的影響見表4。

表4 火麻油結合運動對骨質疏松大鼠骨密度的影響Table 4 Effects of hemp oil combined with exercise on bone mineral density in osteoporotic rats

從表4得出，模型組大鼠骨鈣素（OC）與對照組相比明顯提高（P＜0.05），運動組、火麻油組、火麻油運動組大鼠骨鈣素（OC）與模型組相比明顯降低（P＜0.05），火麻油運動組大鼠骨鈣素（OC）與對照組相比不具有顯著性差異（P＞0.05）；模型組大鼠磷（P）與對照組相比明顯降低（P＜0.05），火麻油運動組磷（P）與模型組相比明顯提高（P＜0.05），火麻油運動組磷（P）與對照組相比不具有顯著性差異（P＞0.05）；模型組大鼠雌二醇與對照組相比明顯降低（P＜0.05），運動組、火麻油組、火麻油運動組雌二醇與模型組相比明顯提高（P＜0.05），火麻油運動組雌二醇與對照組相比不具有顯著性差異（P＞0.05）；模型組大鼠骨密度與對照組相比明顯降低（P＜0.05），火麻油運動組骨密度與模型組相比明顯提高（P＜0.05），火麻油運動組骨密度與對照組相比不具有顯著性差異（P＞0.05）。

研究表明女性在絕經之后骨質疏松癥狀逐年提高[19]，骨質疏松是一種多原因引發骨量丟失，骨結構退化的疾病[20]。運動是當前治療骨質疏松的重要方法，相對來說跑步、走路等運動對于骨密度的增加使其產生的效果需要在10～12個月左右，所以通過食物或者藥物來配合可以達到更好的效果[21]。本文中大鼠通過切除雙側卵巢后，導致自身代謝出現紊亂，出現骨質疏松癥狀，血清中OC水平可以作為評價骨轉換率以及骨形成的重要指標，磷（P）的水平是評價骨質疏松癥狀效果的重要指標，代表了骨組織中無機物的變化狀態，通過以上指標可以反映骨代謝情況，而且會參與到成骨細胞分化及基質的礦化的整個過程[22]，模型組的血清OC明顯高于其他組，模型組的磷（P）水平明顯低于其他組，表明模型組的骨轉化率高于其他組，骨質疏松癥狀明顯，說明經過有氧運動干預以及灌胃火麻油可以調節骨代謝平衡，降低骨轉換率，起到抑制骨質疏松的作用；雌二醇可以對成骨細胞和破骨細胞的調節來反映機體的骨鈣代謝，模型組的雌二醇低于其他組，說明經過有氧運動干預以及灌胃火麻油可以調節骨鈣代謝之間的平衡，減弱成骨細胞的骨形成能力；骨密度是骨骼強度的一個重要指標，大鼠通過切除雙側卵巢6周后，模型組的骨密度明顯低于其他組，說明經過有氧運動干預以及灌胃火麻油可以抑制破骨細胞分化、阻礙骨吸收，進而改善骨密度，接近正常大鼠的骨密度。并且火麻油結合有氧運動要比運動組和火麻油組單一效果要好。

3 結論

通過溶劑法提取火麻油的最優工藝條件為：當液料比為16∶1（mL/g）、提取溫度為46℃、提取時間為104 min時，火麻油的得率為83.45%。選取該組合做3次驗證試驗，得出火麻油的平均得率為83.39%。與預測值相近，證明該方法的可行性。同時大鼠實驗表明，火麻油結合有氧運動對骨質疏松模型大鼠的骨鈣素（OC）、磷（P）水平、雌二醇水平、骨密度 4項指標起到積極作用。說明經過有氧運動干預以及灌胃火麻油可以調節骨代謝平衡，降低骨轉換率，減弱成骨細胞的骨形成能力，抑制破骨細胞分化、阻礙骨吸收，進而改善骨密度，起到抑制骨質疏松的作用。并且火麻油結合有氧運動的效果要優于兩者單獨作用，為今后的相關研究提供了寶貴經驗。