正交法優化參苓白術散總黃酮的提取工藝

王悅　王婭玲　鄒婧　陶然　高世杰

摘????? 要：目的 為深入研究參苓白術散現代臨床功效，以確保藥效的發揮，本試驗進行參苓白術散總黃酮質量分數測定，正交試驗篩選最佳提取方案。方法 設計單因素試驗，以乙醇的質量分數、用量和提取時間為優化條件，測定參苓白術散中黃酮的質量分數，并對提取工藝進行優化。結果 參苓白術散總黃酮的最優試驗提取工藝：乙醇質量分數為50%，提取時間 2 h，乙醇用量 25 mL。

關? 鍵? 詞：參苓白術散;總黃酮;乙醇提取;正交試驗法

中圖分類號：R284?????? 文獻標識碼： A?????? 文章編號： 1671-0460（2020）06-1039-04

Orthogonal Method was used to Optimize the Extraction Process of Total Flavonoids From Shenling Baizhu Powder

WANG Yue， WANG Ya-ling， ZOU Jing， TAO Ran， GAO Shi-jie

（School of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China）

Abstract： Objective To study the modern clinical efficacy of Shenling Baizhu Powder in depth to ensure the effectiveness of the drug. This experiment was used to determine the total flavonoid content of Shenling Baizhu Powder， and the process was optimized by orthogonal method to screen the best extraction scheme. Methods A single-factor experiment was designed to determine the content of flavonoids in the Shenling Baizhu Powder and to optimize the extraction process， with ethanol concentration， ethanol dosage and extraction time. Results The best extraction process for total flavonoids in Shenling Baizhu Powder is： 50% ethanol concentration， 25 mL of ethanol， extraction time of 2 h.

Key words： Shenling Baizhu Powder; Total flavonoids; Ethanol extraction; Orthogonal experimental method

參苓白術散為古籍醫方，臨床應用歷史悠久。全方由蓮子肉、桔梗、白扁豆、人參、甘草等組成^[1]，能夠益脾和胃、生清降濁、安胎固神，多用于治療脾胃虛弱、舌苔白膩、胸脘痞塞等常見疾病^[2]。本方藥性溫和，具有很好的健脾作用，人參、茯苓、白術共用為君輔以山藥、白扁豆等增強利水滲濕的作用。

該方配伍靈活，功效顯著。茯苓具有安神定驚、調和脾胃的功效^[3]，在治療脾虛、痰飲、濕熱、帶下等方面功效顯著，“十藥九茯苓”便是說茯苓在復方配伍中十分常見^[4];人參為貴重中藥，藥性溫和，能夠補益元氣^[5]、延緩衰老、安神定驚^[6]，具有安神固元、延年益壽的作用;白術能夠利水滲濕、止汗安胎^[7]，能夠調節脾胃運動、增強免疫、降脂等，三者共用為君以增強參苓白術散的功效。

與中藥抗腫瘤、抗菌等方面的研究相比，中藥抗氧化方面的研究仍較為薄弱^[8]，因此該試驗采用正交法優化參苓白術散中總黃酮的提取條件，通過常溫下測定的吸光度計算總黃酮含量，可為參苓白術散總黃酮體外抗氧化活性及其機制的研究提供試驗依據。

1? 試驗

1.1? 材料

1.1.1? 藥材

參苓白術散粉末（市售，經鑒定）。

1.1.2? 試劑

蘆丁對照品，三氯化鋁，乙醇等均為分析純。

1.1.3? 儀器

高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技有限公司）;可見分光光度計;遠外紅輻射干燥箱;循環式真空泵;電子天平^[9]。

2? 試驗過程

2.1? 標準曲線繪制

取蘆丁標準品 0.02 g，加入乙醇密封超聲助溶，移液槍依次取對照品溶液加到試管中，各自加30%乙醇稀釋至 5 mL，依次加入 0.3 mL 5%的亞硝酸鈉，震蕩;再加0.6 mL 10%三氯化鋁;然后加2 mL 4%氫氧化鈉，用30%乙醇稀釋，搖勻，靜置15 min，于 510 nm處測其吸光度^[10]。

2.2? 參苓白術散待測液

精密稱量參苓白術散約 1.00 g，向其中加入定量乙醇，采用乙醇回流的方法回流2 h，離心，傾出上清液，定容備用。

2.3? 質量分數測定

將上述制備好的溶液備用，參照蘆丁標準曲線的制備方式，測定參苓白術散中總黃酮的吸光度，于常溫下進行，帶入標準曲線中，計算參苓白術散中總黃酮的質量分數。

2.4? 單因素試驗

本試驗以參苓白術散復方為試驗材料，以最終黃酮得率為指標進行試驗，對乙醇的用量、質量分數和提取時間三個變量進行試驗。

2.5? 正交試驗

采取乙醇質量分數、乙醇用量、提取時間 3 個因素，在每個因素中挑選 3 個水平，開展正交試驗，以參苓白術散中總黃酮提取量為考核標準，見表1 。

3? 結果分析

3.1? 標準曲線測定

如圖1所示， 繪制吸光度-蘆丁溶液的表達式，得回歸方程：Y = 8.705x- 0.01，R²= 0.999 2。

3.2? 單因素試驗

3.2.1? 乙醇濃度

由圖 2 可知，黃酮的提取受乙醇質量分數的影響較為明顯，在乙醇質量分數40%～60%梯度內呈開始上升然后下降的變化，乙醇質量分數為 50%時得到的黃酮最多，乙醇質量分數的逐漸升高抑制了黃酮的提取，可能原因為高質量分數乙醇在常溫下極易揮發，濃度越高揮發效果越強，主要成分乙醇揮發在空氣中。

3.2.2? 乙醇用量

由圖 3 可知，總黃酮質量分數測定過程中乙醇的最大用量為 30 mL，在試驗用量范圍內，總黃酮得率一直呈上升趨勢，受試驗條件和實際應用中節省材料考慮，選擇乙醇用量為 30 mL。

3.2.3? 提取時間

根據圖 4 ，當提取時間變長時，總黃酮質量分數表現出先逐漸升高，黃酮質量分數在2.5 h 時最大，提取最充分，而后降低。回流時間過長易導致其有效成分的破壞，并且其他物質的溶出易導致提取的黃酮摻雜。

3.3? 正交試驗結果

此試驗查核了乙醇的用量、質量分數、提取時間共三個變量對試驗結果的作用，設計正交試驗，記L₉（3⁴），見表 2。方差結果分析見表3。

由表2 、表3可以看出，三個因素之間，乙醇質量分數對參苓白術散中黃酮的提取影響最大，其次，乙醇用量的作用較次之，對提取時間來說，它的極差最小，作用最不顯著，對最后的結果影響最低。另外，對比乙醇質量分數各水平為K₁>K₂>K₃，表示這三個水平中，用 50%乙醇較好;乙醇用量各水平比較是K₃>K₂>K₁，所以選擇 25 mL 乙醇用量較優;在時間方面，其每水平之間比較為K₂>K₁>K₃，能夠看出2 h 為最佳提取時間。綜上，最佳提取工藝組合為：A₁ B₃ C₂。

3.4? 結果

據以上正交試驗結果，按優選出的試驗條件進行重復性試驗，以黃酮提取量為指標，結果見表 4。

4? 討論

現代臨床試驗證明參苓白術散具有調節人體免疫功能、減少感染、促進腸道蠕動的作用。李姿

慧^[11]等結合大鼠試驗表明參苓白術散在治療潰瘍性結腸炎方面作用顯著，療效突出，能夠減少瀉下，緩解大便溏薄癥狀^[12];李烜運用參苓白術散治療中晚期胃癌能夠有效減少腫瘤惡化，減少病灶轉移，減輕患者痛苦;雷遠忠^[13]對參苓白術散配方進行加減調和，發現對于脾虛型哮喘具有較好的治療效果，氣喘現象減少，呼吸更加順暢，發作頻率也逐漸減少。

現今，已知的提取黃酮類化合物的方法以酶輔助提取法^[14]、溶劑提取法^[15]、超聲輔助提取法^[16]、超臨界CO₂萃取法^[17]、微波輔助提取法^[18]為主，除此之外，還有多種方法需要我們去探索。本試驗采用有機溶劑提取法，以乙醇促進黃酮溶出。采用乙醇回流提取能夠使參苓白術散中乙醇溶解更充分。通過將乙醇作為溶劑，對其不同濃度、用量以及提取時間考察，把參苓白術散總黃酮作為衡量標準，設計正交試驗，最終確定組方中總黃酮的最優提取方案：乙醇質量分數為50%，乙醇用量為 25 mL，提取時間為2 h，為今后中藥組方的抗氧化方面的研究奠定良好的基礎。

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