響應曲面優化食品接觸用紙中異噻唑啉酮類殺菌劑殘留量的測定條件

鄭學殷　黃嘉樂　許志彬　李瑞玲　曾廣豐

摘????? 要：建立了超高效液相色譜-串聯質譜法對食品接觸用紙和紙板中異噻唑啉酮類殺菌劑含量進行快速測定。樣品用甲醇重復提取后，旋轉蒸發濃縮，甲醇復溶，同時以回收率為指標，結合響應曲面分析優化前處參數。以流動注射方式優化5種異噻唑啉酮類化合物的質譜參數，以電噴霧離子源正離子模式電離，結合多反應監測模式進行測定。5種異噻唑啉酮類化合物在5.0～200 μg·L^-1范圍內標準曲線線性良好，相關系數r均大于0.998 9，平均回收率為82.1%～95.2%，方法檢出限為5.0～10.0 μg·kg^-1，方法定量限為15.0～35.0 μg·kg^-1，相對標準偏差RSDs為5.15%～6.49%。該方法簡單高效、回收率高、靈敏度高和重現性好均能達到分析測定要求，可用于食品接觸用紙和紙板中異噻唑啉酮類殺菌劑的測定。

關? 鍵? 詞：超高效液相色譜-串聯質譜;食品接觸用紙和紙板;異噻唑啉酮;殺菌劑;響應曲面優化

中圖分類號：O657.63; TS762.6 ?????文獻標識碼： A??? ??文章編號： 1671-0460（2020）06-1253-05

Optimization of Determination Conditions of Isothiazolinone Fungicides Residues in Food Contact Paper by Response Surface Methodology

ZHENG Xue-yin¹， HUANG Jia-le¹， XU Zhi-bin¹， LI Rui-ling²， ZENG Guang-feng³

（1. National Quality Testing Center for Processed Food （Guangdong）， Guangzhou Inspection and Testing Certification Group Company， Guangzhou Guangdong 511447， China;

2. SGS-CSTC Standards Technical Services Co.， Ltd.， Guangzhou Guangdong 510000， China;

3. Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center， Guangzhou Guangdong 510623， China）

Abstract： A method for determination of isothiazolinone fungicides in food contact paper and cardboard by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） was established. Samples were extracted by methanol repeatedly， then rotary evaporation was carried out to concentrate the samples， finally the samples were redissolved by methanol. The recovery rate was used as an indicator to optimize the pre-processing parameters with the response surface analysis. The mass spectrometry parameters of five isothiazolinone compounds were optimized by flow injection under positive mode of the electron spray ionization （ESI +） ， data of the analytes were obtained with mass spectrometric multiple reaction monitoring （MRM） mode. Five isothiazolinone compounds exhibited good linearity with correlation coefficient（r>0.998 9） when the concentrations ranged from 5.0 to 200 μg/L. The average recoveries of three spike levels were 82.1%～95.2%， while the limits of detection and the limits of quantitation were ranged 5.0～10.0 μg·kg^-1 and 15.0～35.0 μg·kg^-1， respectively. The relative standard deviations （RSDs） were ranged 5.15%～6.49%. This method is easy to operate， and its recovery， sensitivity and reproducibility could achieve the requirements of determination for isothiazolinone fungicides in food contact paper and cardboard.

Key words： Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Food contact paper and cardboard; Isothiazolinone; Fungicide; Response surface methodology

異噻唑啉酮類殺菌劑是一種高效的廣譜殺菌劑，對細菌、真菌及藻類等具有很強的抑制和殺滅作用^[1-2]，由于其具有低毒，高效、廣泛殺菌等特點，所以被優良的殺菌劑應用于農業、工業等生產領域的防霉防腐^[3]。但在工業生產的同時，環境的污染問題也成為首要關注的問題。由于其優越性，在工業生產的過程中也很容易出現濫用的情況，由于大量的排放，導致了水體中的殘留^[4-5]。近年有研究報道顯示，異噻唑啉酮類殺菌劑對人體皮膚會有過敏作用和炎癥效應^[6-8]，對于食品接觸用紙的生產工業，若出現濫用的情況，對食品安全和消費者的人身健康有可能會造成重大的威脅。

目前對于異噻唑啉酮類殺菌劑的檢測方法主要為高效液相色譜法^[9]、氣相色譜法^[10]、氣相色譜-質譜聯用法^[11-13]和液相色譜-串聯質譜法^{[5，14，15]}。液相色譜法和氣相色譜法檢測成本較低，但儀器選擇性低，檢出限高，分析時間長，雜質較多，影響分析結果。氣相色譜-質譜聯用法和液相色譜-串聯質譜法利用四極桿對目標物進行篩選分離，能大大降低雜質對分析結果的影響，同時，檢出限較低，對于監管產品安全問題，具有更廣泛的應用。本文建立了超高效液相色譜-串聯質譜法對5種異噻唑啉酮類殺菌劑的殘留量進行同時測定，經方法學的數據分析，本方法回收率高，靈敏度高，重現性好，適合在日常檢驗中應用，同時，采用響應曲面優化設計^[16]，對測定條件進行優化，可應用于化工生產過程中的有毒有害物的監控。

1? 實驗部分

1.1? 儀器與設備

高效液相色譜-質譜/質譜聯用儀，配有電噴霧電離源（ESI）和MRM模式（4000Q，AB SCIEX公司）;電子天平;旋轉蒸發儀;離心機，最大轉速為10 000 r/min;超聲波清洗器;渦旋混勻器。

1.2? 材料與試劑

食品接觸用紙和紙板樣品（購自廣州市批發市場）;甲酸（色譜純，Aladdin）;甲醇、乙腈（HPLC，購自賽默飛世爾公司）;標準對照品：5-氯-2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、4，5-二氯-2-正辛基-4-異噻唑啉-3-酮、2-甲基異噻唑啉-3-酮、1，2-苯并異噻唑啉-3-酮、2-辛基-4-異噻唑啉-3-酮（DR，購自安譜公司，純度均為≥98%）。

1.3? 實驗條件

1.3.1? 標準溶液的配制

基質空白溶液：用5種異噻唑啉酮呈陰性的樣品進行前處理，得到的溶液即為基質空白溶液。

標準儲備溶液：稱取適量標準品于棕色容量瓶中，加入少量甲醇超聲溶解，并用甲醇稀釋至刻度線，得到標準儲備溶液，質量濃度為1 mg·mL^-1。該儲備溶液于2～8 ℃下避光保存。

混合標準工作溶液：分別準確移取一定體積的每種標準儲備液，分別用甲醇和基質空白溶液重新定容成適當濃度為5，10，20，50，100，200 ?g·L^-1的混合標準工作曲線，曲線分別為溶劑曲線和基質曲線，于4 ℃下避光保存。

1.3.2? 樣品前處理

將食品包裝紙或紙板剪成0.3 cm²大小的碎片，稱取1 g （精確到0.01 g） 試樣置于具塞離心管中，加入10 mL 甲醇，超聲提取15 min。以10 000 r·min^-1 離心5 min，提取液倒入干凈的旋轉蒸發瓶，重復提取一次，提取液倒入同一個的旋轉蒸發瓶。旋轉蒸發溶劑近干，用2 mL甲醇定容，過0.22 μm 微孔濾膜后供高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.4? 儀器條件

1.4.1? 色譜條件

色譜柱：Waters BEH C₁₈ （100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）;柱溫為35 ℃;進樣量為5 μL;流動相A為甲醇，B為0.1%甲酸水溶液（體積分數），流速為0.5 mL·min^-1;采用梯度洗脫程序淋洗：0～3.0 min，50% A;3.0～5.0 min，50%～95% A;5.0～8.5 min，95% A;8.6～12.0 min，50% A;8.6～12.0 min，50% A。

1.4.2? 質譜條件

LC-MS/MS 掃描方式：電噴霧電離源（ESI+）;氣簾氣：25 psi;電離電壓（IS）：4 500 V;離子源溫度（TEM）：550 ℃;霧化氣（GAS1）：50 psi;加熱輔助氣（GAS2）：50 psi;碰撞氣（CAD）：medium;采集模式：多反應監測（MRM）模式。

1.5? 響應曲面設計

實驗基于優化后的甲醇用量，結合提取次數和超聲時間，設計響應曲面實驗，Box Behnken設計模型來設計提取因素條件，以提取次數（X₁），超聲時間（X₂， min），溶劑用量（X₃， mL） 三個因素為計變量，實驗水平范圍見表1。

2? 結果與分析

2.1? 質譜參數的優化

由于5種異噻唑啉酮化合物均含有N原子，具有一定的電負性，在電噴霧正離子模式下更容易形成[M+H]⁺的準分子離子峰，且豐度較高，因此選用正離子模式進行測定。以流動注射的方式將標準溶液注入離子源，并以正離子模式對母離子進行掃描，確定母離子質荷比后，進行母離子的二級碎片掃描，選擇響應值較高的兩個碎片作為定量和定性離子，最后通過（multiple reaction monitoring， MRM）模式分別對各個碎片的去簇電壓（declustering potential， DP）和碰撞電壓（collision energy， CE）進行優化，使各個碎片能達到較好的靈敏度。詳細見表2。5種異噻唑啉酮提取離子流色譜圖見圖1。

2.2? 提取溶劑的選擇

在實驗前期對提取溶劑的選擇做了初步的選擇，由于5種異噻唑啉酮化合物具有一定的極性，因此選擇極性較大的溶劑有利于回收率的提高，最終選擇了甲醇和乙腈作為提取溶劑，并在提取兩次合并的情況下，以5種異噻唑啉酮的平均回收率作為考察依據，分別考察了甲醇和乙腈用量對回收率的影響，結果表明，在同等用量的情況下，甲醇作為提取溶劑，回收率更高，同時當甲醇用量達到10 mL時，5種異噻唑啉酮回收率達到了分析要求，而用量上升時，回收率差異不明顯，考慮到旋轉蒸發的時間和耗材成本，最終選取10 mL甲醇提取兩次合并作為前處理條件，詳細結果見圖2。5種異噻唑啉酮在此條件下的回收率見圖3。

2.3? 基質效應

由于前處理方法采用甲醇直接提取，因此，提取液中雜質較多，在質譜中有可能存在基質效應從而影響目標物離子化程度，所以對5種異噻唑啉酮的基質效應程度進行了探究。

用基質空白溶液配制單點混合標準液，計算得出的回收率K值。若基質效應不明顯，則此回收率應為90%～110%之間。而單點基質混合標準中5種異噻唑啉酮的K值在為53%～73%，該前處理方法對5種異噻唑啉酮的分析具有較明顯的基質效應，采用基質曲線進行計算校正后，回收率達到日常檢驗的要求。

2.4 ?響應曲面優化設計

為了優化5種異噻唑啉酮的最佳提取條件，采用Box Behnken響應曲面設計優化提取次數（X₁），超聲時間（X₂，≠min），溶劑用量（X₃，≠mL）等3個提取條件。實驗選擇回收率較低的2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮為代表分析對象，采用ANOVA方差分析對數據結果進行分析評價，結果詳見表3。

分析結果顯示，提取次數、超聲時間和溶劑用量的一次因素（檢驗P值為0.000 1、0.002 2和0.001 0）和提取次數的二次因素（檢驗P值為0.000 1）為顯著影響因素，缺省驗證實驗的P值為0.507 5，模型的P值為0.000 1，顯示顯著水平。根據系統推薦的二次方程進行擬合，得到2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮的擬合曲線預測方程為（1），擬合相關系數R²為0.976 3。

y =89.30+6.58X₁+2.49X₂+2.86X₃+1.50X₁X₂+1.45X₁X₃+0.77X₂X₃-5.96X₁²-1.54X₂²-0.44X₃²。（1）

對實驗結果進行分析后，以2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮代表分析物的回收率為基礎，進行模型建立與預測，得到各個因素相應的三維立體圖（圖4），能更直觀地分析相對較佳組合。結合檢測成本等因素考慮，最終選取提取條件為提取次數2次，超聲時間15 min，甲醇用量10 mL作為提取條件。在此因素水平組合下，5種異噻唑啉酮類殺菌劑均獲得較好的平均回收率。

2.5? 方法的線性范圍和檢出限

在本方法所確定的實驗條件下，用基質空白將混合標準溶液稀釋至5、10、20、50、100、200 ?g·L^-1進行測定，以峰面積和濃度進行標準曲線繪制，結果表明，擬合曲線線性良好（見表4），相關系數均大于0.998 9，方法的檢出限和定量限分別為5.0～10.0和15.0～35.0 μg·kg^-1，表明方法的靈敏度較好，可應用于日常檢測。

2.6? 回收率與精密度實驗

對市售的產品進行批量測定，為方便加標水平的確定，選取陰性的樣品進行標準添加試驗，按照5種異噻唑啉酮最大定量限的1倍、2倍和5倍三個水平進行添加，并對每一水平平行測定6次，計算日內相對標準偏差，以考察實驗重復性。測定結果為平均回收率在82.1%～95.2%之間，相對標準偏差RSD為5.15%～6.49%。

結果表明，經基質曲線校正和響應曲面優化后的回收率能達到分析測定的要求，且精密度也較高，說明實驗重復性較好。詳細結果如表5所示。