嬰幼兒腹瀉人群中鼠傷寒沙門菌的流行病學及多重耐藥特征研究

王路梅，郭 惠，童 晶，吳畏畏，劉庭君，鄭東宇

鼠傷寒沙門菌是沙門菌屬中引起小兒腸道感染最常見的致病血清型[1-2]，屬于沙門菌群B群。人群對鼠傷寒沙門菌普遍易感，嬰幼兒多為顯性感染，以胃腸型為主[3]，相關研究中多是以兒童為研究對象，嬰幼兒(0～3歲)感染資料尚不足。嬰幼兒免疫功能尚未完善，抵抗力較弱，抗菌藥物是治療兒童鼠傷寒沙門菌腸炎的重要手段，多重耐藥鼠傷寒沙門菌已在世界各地陸續報道[4-5]，耐頭孢菌素鼠傷寒沙門氏菌的出現及數量的增加已經引起全世界的關注，成為臨床治療的難點。為了掌握鼠傷寒沙門菌在嬰幼兒腹瀉人群中的流行情況，了解其多重耐藥特征，防止多重耐藥菌在弱勢人群中的傳播，遏制不合理抗生素應用，本研究對2014—2018年徐州地區嬰幼兒腹瀉人群進行了鼠傷寒沙門菌監測，并對其耐藥特征和多耐藥菌株之間的分子流行病學關系進行探討。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 標本來源 依托全國食源性疾病監測系統，收集2014－2018年徐州市醫院1 343份嬰幼兒(0～3歲)腹瀉病患者糞便標本，病例以腹瀉癥狀為主訴，近1周內未使用過抗生素，每日排便大于3次及3次以上，且糞便性狀異常。

1.1.2 質控菌株 血清分型質控菌株為鼠傷寒沙門氏菌ATCC140128，藥敏試驗質控菌株為大腸埃希氏菌ATCC25922，上述菌株購自中國工業微生物菌種保藏中心(CICC)，脈沖場凝膠電泳分子量標準菌株為沙門氏菌H9812，由江蘇省疾病預防控制中心食安所提供。

1.1.3 主要儀器和試劑 VITEK 2 COMPACT全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(法國梅里埃公司);PCR擴增儀、脈沖場凝膠電泳系統、凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司);SBG增菌液(廣州環凱微生物試劑有限公司);科瑪嘉沙門顯色培養基(上海科瑪嘉微生物技術有限公司);沙門氏菌屬診斷血清(寧波天潤生物制品研究所及丹麥S&A);Vitek GN鑒定卡、GN 13、GN 14藥敏測試卡(法國梅里埃公司);藥敏測試用紙片:頭孢他啶30μg、頭孢他啶/克拉維酸30/10μg和頭孢噻肟30μg、頭孢噻肟/克拉維酸30/10μg，(英國OXID公司);限制性內切酶Xba I、Bl n I購自寶生物工程(大連)有限公司;脈沖場電泳用瓊脂糖為Sea Kem○RGold Agarose低熔點瓊脂(美國Ca mbrex公司);蛋白酶K為德國Merck公司產品。質粒小提取試劑盒(DP106)為天根生化科技公司產品。

1.2 方 法

1.2.1 分離鑒定 按照《GB 4789.4-2016食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門菌檢驗》、2014－2018《全國食源性疾病監測工作手冊》進行沙門菌的分離、鑒定病原學表型檢測。

1.2.2 沙門菌血清分型 按照考夫曼抗原表[6]，將鼠傷寒沙門氏菌分為雙相的鼠傷寒沙門菌血清型(1，4，12:i:1，2)和單相變體的鼠傷寒沙門菌變種血清型(1，4，12:i:—)。

1.2.3 耐藥模型檢測 采用VITEK 2 Co mpact GN13和GN14藥敏系統的最低抑菌濃度法(MIC)測定72株菌對10類抗生素18種代表藥物的敏感性。參照CLSI M100-S26[7]《美國臨床和實驗室標準協會抗菌藥物敏感性試驗標準》進行抗生素分類和判斷結果。按照臨床實際用藥規范[8]，排除對沙門菌無效的一代頭孢，根據多重耐藥定義[9]，對上述3類或3類以上抗菌藥物不敏感定義為MDR(multidrug resistant)，對上述6類或6類以上抗菌藥物不敏感定義為XDR(extensive drug resistant)。

1.2.4 產ESBLs表型檢測 按照CLSI M100-S26[7]中的雙紙片協同法來確定鼠傷寒沙門菌的產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)耐藥表型，并且嚴格進行質量控制。

1.2.5 產ESBLs耐藥基因CTX-M檢測及產物確定 對產ESBLs表型菌株檢測常見耐藥基因CTXM及其亞型，按照細菌質粒提取參考小提試劑盒說明書的堿裂解法對細菌質粒DNA進行提取，對6種特異耐藥基因[5]進行PCR擴增，PCR反應條件為:95℃預變性5 min;94℃變性15 s，退火15 s，72℃延伸30 s，反應共30個循環;72℃延伸5 min。PCR陽性擴增片段送上海生物工程公司測序驗證，使用BLAST在Gen Bank上查詢比較，確定基因亞型。

1.2.6 PFGE分型及數據分析 PFGE操作實驗操作過程采用Pulse Net標準操作手冊規定進行。PFGE結果采用Bio Nu merics(Applied—maths公司，ver6.6)進行分析處理，采用UPGMA法進行聚類分析。

1.3 統計處理 數據統計計算用Excel 2007構建病原菌流行特征，分析統計耐藥情況，采用SPSS 16.0軟件進行統計分析。兩組間比較采用卡方檢驗或者校正卡方檢驗，單向有序計數資料的變化趨勢用趨勢卡方分析，檢驗水準α＝0.05。

2 結 果

2.1 鼠傷寒沙門菌在嬰幼兒腹瀉人群中的流行病學特征

2.1.1 時間分布 2014－2018年，1 343份腹瀉嬰幼兒標本中，共檢出178株沙門氏菌(13.25%)，其中鼠傷寒沙門菌檢出72株(5.36%)。2014－2018年沙門菌(χ2趨勢＝21.23，P＜0.01)和鼠傷寒沙門菌(χ2趨勢＝16.02，P＜0.01)檢出率均呈逐年上升趨勢;5年間，鼠傷寒血清型在沙門菌中的占比亦呈逐年增高的趨勢(χ2趨勢＝18.47，P＜0.01)，2018年達到最高為62.50%，見表1。沙門菌全年均有檢出，鼠傷寒沙門菌僅在2－11月才有檢出，沙門菌檢出高峰出現在6月(19.25%)，鼠傷寒沙門菌檢出高峰出現在5月(8.16%)，5－10月沙門菌的檢出率均處于較高水平，見圖1。

表1 2014－2018年徐州地區嬰幼兒腹瀉人群中鼠傷寒沙門菌檢出情況Tab.1 Detection of salmonella typhus in infant and infant diarrhea patients in Xuzhou region from 2014 to 2018

圖1 2014－2018年患兒鼠傷寒沙門菌及沙門菌感染發病時間Fig.1 Onset time of salmonella typhus and salmonella infection in children from 2014 to 2018

2.1.2 年齡、性別分布 1 343例嬰幼兒腹瀉人群年齡范圍為0 d～3歲，平均年齡1歲2個月，中位數為1歲4個月;72例鼠傷寒檢出人群的年齡范圍為:7 d～3歲，沙門菌和鼠傷寒沙門菌在1～3歲幼兒組的檢出率均高于＜1歲嬰兒組(χ2＝88.91，P＜0.01;χ2＝80.53，P＜0.01)(見表2);男患兒鼠傷寒檢出率為54.9%(45/859)，女患兒為13.22%(27/484);男女病例之比為1.67∶1，檢出率在性別間差異無統計學意義(χ2＝0.02，P＞0.05)。

2.1.3 臨床感染特征和飲食史 1 343份腹瀉患兒樣本中，膿血便中鼠傷寒沙門菌的檢出率為22.84%(37/162)，高于稀便的3.89%(13/334)、水樣便的2.89%(12/415)、粘液便的2.62%(10/382)(χ2＝105.66，P＜0.01)，米泔樣便、鮮血便和其他便未有檢出鼠傷寒沙門菌。56.9%(41/72)的鼠傷寒感染患兒出現發熱。經過餐飲史調查表明，48.6%(35例)陽檢患兒為正常飯菜飲食，23.6%(17例)為混合飲食，12.5%(9例)為母乳喂養，15.28%(11例)為奶粉喂養。

表2 72株鼠傷寒沙門菌在嬰幼兒腹瀉人群中年齡分布Tab.2 Age distribution of 72 strains of salmonella typhimurium in infant diarrhea population

2.2 72 株鼠傷寒沙門菌耐藥情況 藥敏結果顯示，耐藥率＞90%的抗生素有:一代頭孢類藥和頭霉素類、氨基糖苷類的阿米卡星，慶大霉素，妥布霉素;耐藥率＞80%的抗生素有:青霉素類的氨芐西林、β-內酰胺酶抑制劑復合物中的氨芐西林/舒巴坦。耐藥率＜10%的抗生素有:哌拉西林/他坐巴坦，厄他培南，亞胺培南，呋喃妥因，左氧氟沙星。產ESBLs表型陽性株對氨芐西林/他唑巴坦、頭孢吡肟、氨曲南的耐藥率高于非產ESBLs表型株(χ2＝4.57，P＜0.05;χ2＝38.66，P＜0.01;χ2＝45.53，P＜0.01)，單相變體的鼠傷寒沙門菌變種血清型(1，4，，12:i:－)和雙相的鼠傷寒沙門菌血清型(1，4，12:i:1，2)之間的耐藥特征差異均無統計學意義(P＞0.05)，詳見表3。

表3 72株鼠傷寒沙門菌耐藥情況[耐藥數(%)]Tab.3 Drug resistance of 72 strains of Salmonella typhimurium[numberof drug resistance(%)]

A M-氨芐西林、A MS-氨芐西林/舒巴坦、TZP-哌拉西林/他唑巴坦、CFZ-頭孢唑林、CTT-頭孢替坦、CAZ-頭孢他啶、CTR-頭孢曲松、FEP-頭孢吡肟、ATM-氨曲南、ETP-厄他培南、I MP-亞胺培南、AK-阿米卡星、GM-慶大霉素、TM-妥布霉素、CIP-環丙沙星、LEV-左氧氟沙星、F/M-呋喃妥因、SXT-甲氧芐啶/磺胺甲惡唑。

2.3 耐藥模型及多重耐藥情況 65株(90.28%)鼠傷寒沙門菌為多重耐藥菌，其中，30株(41.67%)為MDR，呈現XDR耐藥的有35株(48.61%)，72株鼠傷寒沙門菌對18種抗生素的耐藥譜呈37種模型;最多對9類14種抗生素耐藥，詳見表4。

表4 72株鼠傷寒沙門菌的多重耐藥模型Tab.4 Model of multiple drug resistance of 72 strains of salmonella camphoris in mice

2.4 產ESBLs鼠傷寒的耐藥表型及CTX-M各耐藥基因檢測 72株鼠傷寒沙門菌中，15株(20.83%)產ESBLs表型，其中13株攜帶CTX-M通用基因，3株來自2014年，2株來自2015年，8株來自2016年，2株來自2018年。對13株菌進行耐藥基因擴增分型，結果顯示4株blaCTX-M-1、9株bla CTX-M-9擴增結果陽性。對PCR產物進行測序，序列通過BLAST比對，發現分別與已知的blaCTX-M-1、blaCTX-M-9序列100%同源。CTXM-2組及CTX-M-8/CTX-M-25組擴增結果均為陰性，陰性對照成立。

2.5 PFGE圖譜聚類分析結果 72株鼠傷寒沙門菌可分為66個PFGE帶型，相似度在57.2%～100%之間變化，按照90%以上的相似度，可分為11個聚類。37株菌的相似度在90%～96.6%之間變化，包含多重耐藥菌和非多重耐藥菌;相同耐藥譜的菌株之間帶型相似度均＜80%;12株鼠傷寒沙門菌變種之間的PFGE圖譜特征相似度＜80%;9株多重耐藥鼠傷寒沙門菌出現4簇100%一致帶型，其中1簇為2株2018年不同時間分離的鼠傷寒沙門菌和鼠傷寒沙門菌變種，均為多重耐藥菌。1簇為2017年5月13日分離的鼠傷寒沙門菌。1簇為分別于2016年、2018年分離的2株鼠傷寒沙門菌，1簇分別為2016年、2017年、2018年分離的3株鼠傷寒沙門菌。2株非多重耐藥鼠傷寒沙門菌出現一簇100%一致帶型，為分別于2017年5月和10月分離，詳見圖2。

2.6 院內感染流行病學調查 172例鼠傷寒患兒中，1例為2016年9月1日發現新生兒院內感染。對其父母親、護理人員的糞便、手標本、產婦傷口、產道等樣本進行連續3天病原檢索，均未檢出病原菌;產婦為剖宮產，近1周內無細菌感染史。2016年8月24日患兒出生時一切正常，于7天后出現哭鬧不適，膿血便(11次/日);糞便培養檢出鼠傷寒沙門菌。遂查看該醫院同一病區近1個月內住院病人資料，2016年8月27－30日，同一病區有2例住院患者為鼠傷寒沙門菌感染。患兒發病后，醫院加強消毒處理，醫院外環境、護士標本中均未檢出病原。綜上，此例為嬰兒出生后在院內發生的交叉感染。

3 討 論

鼠傷寒沙門菌是目前世界各國分離率最高的沙門菌型之一，主要以兒童感染為主[10]，在我國臨床感染沙門菌中27.4%是由鼠傷寒沙門菌引起的[11]。2014－2018年徐州地區嬰幼兒腹瀉人群中鼠傷寒感染率在沙門菌中的占比為40.45%，其中2018年高達62.50%，并呈逐年上升的趨勢。和文獻中兒童鼠傷寒感染數據范圍(16.0%～68.6%)相比，處于較高水平[12-16]。0～3歲的腹瀉人群中，以1～3歲幼兒年齡組檢出率較高，相對于0～1歲的嬰兒時期，幼兒的戶外活動頻繁，易食用不潔食品及飲品，感染的風險增加。本組研究中，最小嬰兒發病年齡僅7 d，小于羅文雄[17]報道的36 d，經調查，本例為剖宮產后住院期間感染，其他地區亦出現鼠傷寒沙門菌引發的初生嬰兒院內交叉感染報道[18]，提示初生嬰兒院內感染的風險;因此，嬰幼兒腹瀉患者已成為該地區鼠傷寒沙門菌感染重點人群，今后應從飲食衛生和院內感染方面加以控制鼠傷寒沙門菌的污染。

圖2 72株鼠傷寒沙門菌的PFGE圖譜聚類分析Fig.2 Cluster analysis of PFGE map of 72 strains of salmonella typhus

脈沖場凝膠電泳(PFGE)現已被廣泛用于多種病原體暴發流行、院內感染的溯源分析中。經過對72株鼠傷寒沙門氏菌進行PFGE分子分型研究顯示，100%一致帶型最多的有3株菌，無明顯的優勢帶型。提示嬰幼兒人群攜帶的鼠傷寒沙門氏菌基因型呈多樣性，沒有優勢的流行基因型。此外，72株鼠傷寒沙門氏菌PFGE帶型無3例以上的地域、時間的聚集性，反映鼠傷寒沙門氏菌在該地區嬰幼兒人群中呈散發流行。值得關注的是，72株鼠傷寒沙門菌中，有9株多重耐菌出現4簇100%一致帶型，提示多重耐藥鼠傷寒菌株在嬰幼兒人群存在小范圍傳播的可能。因此，仍需繼續關注相關耐藥菌的水平傳播。

單相變體鼠傷寒沙門氏菌(1，4，[5]，12:i:－)是鼠傷寒沙門菌的一種血清型，定義為鼠傷寒沙門菌變種，已被證明與鼠傷寒沙門菌具有相似的毒力和耐藥特征。本研究中檢出12株鼠傷寒沙門變種，耐藥情況產生了一致的結論。通過PFGE分子分型溯源，未發現單相變體血清型菌株出現聚集性趨勢，但是樣本量尚少，需要加大樣本量，深入研究。

總體看來，徐州地區鼠傷寒沙門菌嬰幼兒分離株的多重耐藥形勢嚴峻，呈現MDR和XDR的菌株共占比90.28%。ESBLs表型陽性株占20.83%，產ESBLs的菌株應避免使用青霉素類、頭孢菌素類和氨曲南類藥物。產ESBLs鼠傷寒沙門菌的耐藥基因是以攜帶blaCTX-M-1和bla CTX-M-9亞型為主，亞型分布地區的差異與各地臨床使用的抗菌藥物不同有關。作為兒童治療沙門菌感染的首選藥物，三代頭孢類的頭孢他定(25.00%)和頭孢曲松(37.50%)耐藥率令人擔憂，在近期的兒科感染使用中應加以控制，四代頭孢類的頭孢吡肟的耐藥率目前低于20%，仍是頭孢類最佳選擇。哌拉西林/他唑巴坦及碳青霉烯類的厄他培南和亞胺培南目前耐藥率仍呈現較低的水平，左氧氟沙星雖然耐藥率較低(8.33%)，但是對兒童軟骨發育有影響，僅用于治療嚴重沙門菌或多耐藥感染。

由于嬰幼兒人群的鼠傷寒感染相關資料尚少，期望通過本研究能提高臨床對鼠傷寒沙門菌感染及耐藥性的認識，遏制兒科不合理抗生素應用。