高壓脈沖電場輔助提取紫薯酒渣花色苷

馬懿 ，陳曉姣，古麗珍，包文川

1.四川輕化工大學生物工程學院（自貢 643000）；2.固態發酵資源利用四川省重點實驗室（宜賓 644000）

花色苷屬于天然的水溶性色素，其廣泛存在于水果、蔬菜等植物中，具有抗氧化、抗癌、抗心血管疾病等諸多生物學活性[1-3]。因此，花色苷資源的開發利用具有重要的科學價值。紫薯作為一類重要谷物和食品加工材料，富含大量花色苷等營養成分。Clifford[4]研究發現紫薯花色苷含量明顯高于黑米、藍莓、草莓、紫甘藍、葡萄皮。相關研究還發現，利用紫薯為主要原料生產的紫薯酒具有比葡萄酒更高的抗氧化活性[5]。這對于加速紫薯產業的發展奠定較好的理論基礎。紫薯酒在日本成為暢銷產品[6]。然而，以紫薯為原料生產紫薯酒過程中必然產生大量富含花色苷的紫薯酒渣副產物。這些副產物僅被用于飼料喂養或植物肥料，利用率較低，經濟價值不高。因此，將紫薯酒渣進行資源的循環利用，可有效增加其附加值，具有重要的經濟價值和社會效應。

高壓脈沖電場輔助提取作為一種非熱的提取技術[7-8]，對于提取花色苷等穩定性差的天然產物具有重要作用，這可能與細胞壁的破壞，通透性的改變有關。該方法能有效降低活性物質的損失，具有操作簡單、耗時短的優點[9]，被廣泛應用于活性物質提取，但國內外直接利用紫薯發酵酒副產物，提取花色苷的研究還鮮有報道。

因此，試驗以紫薯酒渣為研究對象，通過高壓脈沖電場輔助提取紫薯酒發酵副產物中花色苷，并通過響應面設計優化提取工藝，對于紫薯的深加工和資源利用具有重要應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫薯酒渣（實驗室自制）；矢車菊素-3-葡萄糖苷標準品（純度≥98%，南京景竹生物有限公司）；無水乙醇、鹽酸（均為分析純，成都科龍試劑有限公司）。

UV-Vis光度計（北京普析）；精密pH計FE20型（瑞士Mettler-Toledo公司）；電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli-Qadvantage超純水系統（德國Millpore公司）；高壓脈沖電場提取裝置[10]（實驗室自制）。

1.2 試驗方法

1.2.1 花色苷相對含量的測定

pH示差法能簡便、快速的進行花色苷含量測定[11-12]。其計算方法如下：

式中：M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾質量，449.2 mg/mol；DF為稀釋倍數；ε為摩爾吸光系數，26 900。

1.2.2 花色苷提取方法

在室溫條件下，利用體積分數60%酸性乙醇（pH 3.5），以不同液料比值，通過高壓脈沖電場輔助提取紫薯酒渣中的花色苷。考察電場強度、脈沖數及液料比值等3個因素對花色苷提取率的影響。試驗選擇的電場強度為5，10，15，20和25 kV/cm；脈沖數為4，6，8，10和12；液料比值為5，10，20，30和40（mL/g）。

1.2.3 響應面試驗優化

根據單因素試驗結果，以液料比值、脈沖數以及電場強度等3個因素為變量，以紫薯酒渣花色苷含量為響應值，使用Design-Expert優化高壓脈沖電場提取工藝。響應面設計如表1所示。

表1 響應面試驗因素水平表

1.2.4 DPPH自由基清除能力試驗

根據Kahkonen[13]的自由基清除能力試驗設計方法，測定VC、紫薯花色苷和紫薯酒渣花色苷清除DPPH自由基的能力。分別將2 mL樣品溶液（0.625～1 mg/mL）分別與2 mL 0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液或2 mL蒸餾水混合均勻，避光靜置1 h，測定其在最大吸收時的吸光度As和Ab；再將2 mL DPPH乙醇溶液與2 mL蒸餾水混勻，以相同方法測定Ac。DPPH自由基清除能力根據如式（3）計算。

2 結果與討論

2.1 紫薯酒渣花色苷提取的單因素試驗

2.1.1 電場強度對提取效果的影響

電場強度對紫薯酒渣花色苷提取效果的影響如圖1所示。隨著電場強度加強，紫薯酒渣花色苷含量逐漸增大，電場強度為20 kV/cm時，花色苷的提取效果最好，花色苷含量達到62.1 mg/100 g。這可能是由于較大電場強度導致細胞壁迅速受損，加速花色苷的溶出。然而，當電場強度繼續增大時，過大的電場強度可能破壞花色苷分子結構，影響其穩定性，從而導致花色苷的提取效果呈現下降趨勢。

2.1.2 液料比值對花色苷提取影響

不同液料比值對紫薯酒渣花色苷提取效果的影響如圖1所示。液料比值低于20（mL/g）時，花色苷的提取效果隨著提取液量的增加而增加，而液料比值超過20（mL/g）時，花色苷提取率顯著降低。由此可見，液料比值為20（mL/g）時，提取效果較好。這可能是由于溶液中花色苷含量飽和，而液料比值超過臨界值后，花色苷溶解在溶液中較多，花色苷濃度降低。

2.1.3 脈沖數對花色苷提取影響

脈沖數對紫薯酒渣花色苷提取效果的影響如圖1所示。隨著脈沖數增加，紫薯酒渣花色苷的提取效果逐漸增加，脈沖數10時，花色苷的含量達到62.4 mg/100 mg，這可能與電子脈沖促進細胞壁加速破壞有關。脈沖數直接影響高壓脈沖電場的作用時間，當作用時間在一定的范圍內持續增加時，有助于花色苷的提取。

2.2 回歸模型的建立與分析

通過單因素試驗，以液料比值（A）、脈沖數（B）和電場強度（C）等3個因素為自變量，花色苷含量為響應值，利用Design-Expert軟件，根據Box-Behnken模型進行響應面試驗優化設計，試驗設計及結果如表2所示。

表3為紫薯酒渣花色苷含量的方差分析結果。建立的回歸方程為：Y=63.1+1.84A+1.21B+1.85C+1.7AB-0.73AC-0.28BC-6.28A2-0.97B2-2.8C2。

圖1 單因素對紫薯酒渣花色苷提取率的影響

表2 Box-Behnken試驗設計及結果

表3 方差分析表

該數學模型達到極顯著水平（p＜0.001），而失擬項不顯著（p=0.092 2＞0.05），說明模型的擬合度高，可用于預測紫薯酒渣花色苷的含量。回歸方程的相關系數（R2）為0.981 1，說明各變量與響應值的相關性顯著。3個因素對紫薯酒渣花色苷含量的影響極顯著（p＜0.01），影響順序為電場強度＞液料比值＞脈沖數。各因素的二次項及其交互作用對花色苷含量的影響達到顯著水平。

2.3 交互作用分析

因素交互作用的三維響應面圖如圖2所示。響應面表示在一個自變量為零水平時，另外兩自變量交互作用對紫薯酒渣花色苷含量的影響情況。如圖2所示，液料比值20（mL/g），隨著脈沖數和電場強度增加，花色苷加速從紫薯酒渣中溶出，但電場強度超過20 kV后，提取的花色苷含量出現下降趨勢，這可能與過大電場強度破壞花色苷穩定性有關[14]。由圖2可見，盡管隨著電場強度增加，紫薯酒渣花色苷的含量先增加，之后稍微減少，但其交互作用應主要歸功于液料比值的增加[15-16]。這可能是由于提取溶劑的增加，增強導電性，從而加速物質的溶出。由圖2可見，紫薯酒渣花色苷的提取率受液料比值和脈沖數的交互作用影響較為明顯。

根據預測分析，響應面的最優條件為：液料比值21（mL/g）、電場強度18.3 kV/cm、脈沖數9.3。此時預測響應值為64.02 mg/100 g。在該條件下，紫薯酒渣花色苷的提取含量為63.9 mg/100 g，與理論預測值接近，表明響應面優化模型可用于確定最佳工藝條件。

2.4 紫薯酒渣花色苷清除DPPH能力

圖3展示紫薯酒渣花色苷和紫薯花色苷的DPPH自由基清除能力，并用VC的測定結果作為對照。紫薯花色苷質量濃度為1 mg/mL時，清除DPPH能力達到90.1%。紫薯酒渣花色苷清除DPPH能力也呈現出相似趨勢，隨著紫薯酒渣花色苷濃度增加，其抗氧化能力迅速增加，質量濃度達到1 mg/mL時，其對DPPH的清除率可達81.9%。盡管紫薯酒渣花色苷清除DPPH能力弱于紫薯花色苷，但其與VC的DPPH清除能力相近，說明紫薯酒渣花色苷仍具有較好的抗氧化活性。這可能是因為紫薯的發酵過程使花色苷的分子結構發生改變，從而引起抗氧化活性的變化。

圖2 各因素交互作用對紫薯酒渣花色苷提取率的響應曲面圖

圖3 紫薯花色苷、紫薯酒渣花色苷和VC清除DPPH自由基能力（n=3）

3 結論

通過響應面設計對紫薯酒渣花色苷的提取工藝進行優化，其最優提取工藝為：液料比值21（mL/g）、電場強度18.3 kV/cm、脈沖數9.3。此時預測響應值為64.02 mg/100 g。經試驗驗證，實際含量為63.9 mg/100 g，表明模型能用于預測紫薯酒渣花色苷的提取工藝。DPPH清除能力試驗表明紫薯酒渣花色苷具有較強的抗氧化能力。因此，紫薯酒渣可作為花色苷開發利用的潛在資源。