超聲波輔助浸提苧麻葉蛋白工藝優(yōu)化技術(shù)

陳平，朱愛國，陳繼康，高鋼，陳坤梅，喻春明

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所（長沙 410205）

苧麻為蕁麻科（Urticaceae）苧麻屬（Boehmeria）多年生草本植物，是我國傳統(tǒng)的纖維作物。苧麻纖維具有吸濕、散熱的特性，被譽(yù)為“中國草”。苧麻具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長快、產(chǎn)量高的特點(diǎn)，一年可收獲三季，畝產(chǎn)（1畝=0.067 hm2）鮮物質(zhì)5 300 kg[1]。收獲的纖維只占總產(chǎn)量的1/10左右，大量的葉片等副產(chǎn)物沒有得到很好利用。苧麻葉片中粗蛋白含量在20%以上，必需氨基酸含量豐富，是優(yōu)良的植物蛋白原料[2-5]。苧麻副產(chǎn)物作為反芻動(dòng)物的蛋白飼料開發(fā)也逐漸得到重視[3,6-9]，但其在食品工業(yè)中的研究還鮮見報(bào)道。研究苧麻葉中的蛋白質(zhì)提取工藝用于開發(fā)相關(guān)食品或保健食品，不僅有利于豐富植物蛋白產(chǎn)品種類、充分利用我國的苧麻產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)物資源，而且為進(jìn)一步進(jìn)行苧麻葉蛋白質(zhì)的深入研究和多肽氨基酸的制備提供基礎(chǔ)。

超聲波輔助提取法，具有操作簡便快捷、不破壞提取物原有結(jié)構(gòu)和活性的優(yōu)點(diǎn)，是一種有效的葉蛋白浸提方法，已在黃粱木[10]、紫花苜蓿[11]、釀酒高粱[12]蛋白質(zhì)提取中取得較好的效果。此次試驗(yàn)利用超聲波輔助浸提苧麻葉片中蛋白質(zhì)，通過浸提液中蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，計(jì)算蛋白質(zhì)提取率，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲波提取工藝參數(shù)，為苧麻葉蛋白工業(yè)提取提供試驗(yàn)科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

苧麻材料，纖飼兼用品種“中苧2號(hào)”[13]葉片，2017年5月采集于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所望城試驗(yàn)基地。采后65 ℃烘干48 h，粉碎過40目篩，備用。

Bradford蛋白試劑盒，南京建成生物科技有限公司；鹽酸，國產(chǎn)分析純（AR）。

1.2 儀器與設(shè)備

高速離心機(jī)（Neofuge 1600R），上海力申科學(xué)儀器有限公司；pH計(jì)（FE28）、電子天平（ME204），梅特勒-托利多儀器有限公司；水浴恒溫振蕩器（THZ-82A），常州榮華儀器制造有限公司；試管振蕩混合器（SK-2型），江蘇保慶分析設(shè)備廠；紫外分光光度計(jì)（UV-5100），上海元析儀器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101型），上海科恒實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 基本化學(xué)成分測(cè)定

蛋白質(zhì)含量測(cè)定，凱氏定氮法；粗脂肪含量測(cè)定，索氏抽提法；粗纖維含量測(cè)定，過濾法；灰分含量測(cè)定，直接灰分法。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 葉蛋白的提取工藝

苧麻葉片→于65 ℃烘干48 h→粉碎過40目篩→加入蒸餾水→（超聲波）浸泡提取→過濾→黃褐色澄清透明浸提液

采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，并計(jì)算提取率（葉片蛋白質(zhì)含量使用凱氏定氮法測(cè)定）。此處提取率為浸出液中蛋白總量與試樣中蛋白總量的比值。

1.4.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

首先做單因素試驗(yàn)，研究超聲波破壁時(shí)間、浸提溫度、料液比以及浸提時(shí)間對(duì)苧麻葉蛋白質(zhì)提取率的影響。然后在此基礎(chǔ)上采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)得到最佳工藝條件。

超聲波時(shí)間的選擇：稱取1 g苧麻葉粉末，加35 mL蒸餾水（料液比1∶35 g/mL），調(diào)節(jié)pH 12，充分?jǐn)嚢杌靹颍诠β?50 W超聲波提取0，4，8和12 min，并在25 ℃振蕩水浴鍋中提取20 min，離心（5 000 r/min，4 ℃，20 min），取上清液，測(cè)定其OD值，根據(jù)所做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度，選擇濃度最高時(shí)的所用時(shí)間，為最佳粉碎時(shí)間。

料液比的選擇：稱取1 g苧麻葉粉末，分別按不同料液比（1∶25，1∶35，1∶45和1∶55 g/mL）加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH 12，充分?jǐn)嚢杌靹颍诠β?50 W超聲波提取8 min，并在25 ℃振蕩水浴鍋中提取20 min，離心（5 000 r/min，4 ℃，20 min），取上清液，測(cè)定其OD值，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度及提取率。

提取時(shí)間的選擇：稱取1 g苧麻葉粉末，按料液比1∶45（g/mL）加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH 12，充分?jǐn)嚢杌靹颍诠β?50 W超聲波提取8 min，并在25 ℃振蕩水浴鍋中分別提取20，40，60，80和100 min，離心（5 000 r/min，4 ℃，20 min），取上清液，測(cè)定其OD值，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度及提取率。

提取溫度的選擇：稱取1 g苧麻葉粉末，按料液比1∶45（g/mL）加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH 12，充分?jǐn)嚢杌靹颍诠β?50 W超聲波提取8 min，分別在25，35，45，55和65 ℃振蕩水浴鍋中提取20 min，離心（5 000 r/min，4 ℃，20 min），取上清液，測(cè)定其OD值，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度及提取率。

pH的選擇：稱取1 g苧麻葉粉末，按料液比1∶45（g/mL）加入蒸餾水，調(diào)節(jié)pH為7，8，9，10，11和12，充分?jǐn)嚢杌靹颍诠β?50 W超聲波提取8 min，在55 ℃振蕩水浴鍋中分別提取20 min，離心（5 000 r/min，4 ℃，20 min），取上清液，測(cè)定其OD值，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度及提取率。

1.4.3 最佳工藝條件的選擇

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比、pH、浸提時(shí)間和浸提溫度為考察因素，以苧麻葉蛋白提取率為考察目標(biāo)，采用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在不設(shè)置空列的情況下，各處理均重復(fù)3次，用以估計(jì)誤差。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3次，采用Excel 2016、SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素Turkey方差分析、正交方差分析等處理，以獲得最佳組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 干苧麻葉基本化學(xué)成分

由表1可知，苧麻葉片中的蛋白質(zhì)含量為21.84%，脂肪含量為4.82%，粗纖維含量為24.49%，灰分含量為12.46%。

表1 干苧麻葉基本化學(xué)成分 %

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 超聲波時(shí)間的選擇

由圖1可知，超聲波時(shí)間在8 min內(nèi)，隨著超聲波處理時(shí)間的增加，苧麻葉蛋白的提取率逐漸增加。超聲波處理12和8 min對(duì)提取率的影響無顯著差異（p＜0.05），因此選定8 min作為超聲波處理的時(shí)間。

圖1 超聲波時(shí)間對(duì)苧麻葉蛋白提取率的影響

2.2.2 料液比對(duì)葉蛋白提取率的影響

由圖2可知，葉蛋白提取率隨著料液比增加而提升，當(dāng)料液比達(dá)到1∶45（g/mL）時(shí)，提取率為3.53%。隨著料液比繼續(xù)增加，葉蛋白提取率增長幅度較小。而當(dāng)料液比增加時(shí)，提取液中蛋白質(zhì)濃度降低，這將使蛋白質(zhì)沉降率下降。因此選定料液比1∶35，1∶45和1∶55（g/mL）作為正交試驗(yàn)的三個(gè)水平。

圖2 料液比對(duì)苧麻葉蛋白提取率的影響

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)葉蛋白提取率的影響

由圖3可知，蛋白質(zhì)提取率隨著提取時(shí)間的延長而增加。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到60 min后，蛋白質(zhì)的提取率變化不大。出于節(jié)約時(shí)間和能量考慮，選擇40，60和80 min作為正交試驗(yàn)的三個(gè)水平。

2.2.4 pH對(duì)葉蛋白提取率的影響

由圖4可知，在pH 7～11之間，苧麻葉蛋白的提取率逐漸上升；當(dāng)pH為11時(shí)，提取率為5.73%，達(dá)到最高；當(dāng)pH為12時(shí)，苧麻葉蛋白的提取率出現(xiàn)下降趨勢(shì)。說明pH 11時(shí)苧麻葉蛋白已經(jīng)達(dá)到最大限度的溶解。pH再升高，可能導(dǎo)致苧麻葉蛋白發(fā)生變性，提取率反而降低。所以選擇pH 10，11和12作為苧麻葉蛋白提取正交試驗(yàn)的三個(gè)水平。

圖3 提取時(shí)間對(duì)苧麻葉蛋白提取率的影響

圖4 pH對(duì)苧麻葉蛋白提取率的影響

2.2.5 提取溫度對(duì)葉蛋白提取率的影響

由圖5可知，隨著溫度的升高，苧麻葉蛋白的溶出率逐漸升高。當(dāng)溫度升高到45 ℃后，提取率變化較小，這是由于此時(shí)苧麻葉蛋白已經(jīng)達(dá)到最大限度的溶解。因此，選擇35，45和55 ℃作為正交試驗(yàn)的三個(gè)水平。

圖5 溫度對(duì)苧麻葉蛋白提取率的影響

2.3 最佳工藝條件的選擇

正交試驗(yàn)因子水平見表2，按照表2設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表2 L9(34)正交因子水平表

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

使用SPSS 20.0對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表4。提取時(shí)間、料液比、pH和提取溫度對(duì)葉蛋白提取率影響均極顯著（p＜0.01），各因素對(duì)苧麻葉蛋白質(zhì)得率的影響大小依次為提取時(shí)間＞提取溫度＞料液比＞pH，即在堿提過程中，提取時(shí)間對(duì)苧麻葉蛋白質(zhì)提取率影響最大，提取溫度和料液比次之，pH最小。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析結(jié)果

苧麻葉蛋白的最優(yōu)組合為A2B2C2D2，即最佳提取條件為料液比1∶45（g/mL）、pH 11、溫度45 ℃、提取時(shí)間60 min。經(jīng)驗(yàn)證，該條件下的苧麻葉蛋白的提取率為11.26%，高于正交試驗(yàn)的所有組合，數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。

3 討論與結(jié)論

在單因素試驗(yàn)中，超聲波輔助提取8 min，葉蛋白的提取率最高；處理12 min，提取率略有下降，但與8 min時(shí)的提取率差異不顯著。由于超聲波熱效應(yīng)，試驗(yàn)中溫度控制較為困難，在實(shí)際生產(chǎn)中，仍需解決這個(gè)問題。

試驗(yàn)結(jié)果表明：提取時(shí)間、料液比、pH和提取溫度對(duì)葉蛋白提取率的影響均極顯著（p＜0.01），各因素對(duì)苧麻葉蛋白質(zhì)得率的影響大小依次為提取時(shí)間＞提取溫度＞料液比＞pH。最佳提取條件為料液比1∶45（g/mL）、pH 11、溫度45 ℃、提取時(shí)間60 min，提取率達(dá)11.26%，該工藝通過超聲波處理能高效提取苧麻葉片中的蛋白質(zhì)，為實(shí)際生產(chǎn)提供一定理論依據(jù)。