羅布麻總黃酮泡騰片的制備工藝及抗氧化活性

王慧竹，王禹衡，張興濤，姜詩宇，陳帥

吉林化工學院化學與制藥工程學院（吉林 132022）

羅布麻葉，又名“茶葉花”“野茶”，為夾竹桃科植物羅布麻（Apocynum venetum L.）的干燥葉[1]。羅布麻葉中的化學成分包括黃酮類、有機酸等[2-7]。研究發現，黃酮類是羅布麻主要活性成分，對調節血壓、預防高血脂具有良好療效[5]。泡騰片具有攜帶方便、分散速度快、有汽水般口感等優點而受到國內外廣大消費者的青睞，近幾年在食品及保健品生產中的應用逐漸增多[8-10]。目前關于羅布麻制劑主要有復方羅布麻片、復方羅布麻顆粒等，但普通片劑不便于老年人或吞咽功能低的患者使用，并且已上市的制劑并未對羅布麻黃酮的含量進行控制。此次試驗采用響應面法對羅布麻黃酮泡騰片（AVET）制備工藝進行優化，同時對AVET的抗氧化活性進行研究，以期為開發羅布麻資源提供更加科學的依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅布麻飲片（吉林大藥房，批號20180901）；金絲桃苷（成都曼斯特生物科技有限公司，批號MUST-12040302，純度≥98%）；碳酸氫鈉（天津市瑞金特化學品有限公司）；PEG 6000（天津市致遠化學試劑有限公司）；檸檬酸（天津市永大化學試劑有限公司）；乳糖（天津市瑞金特化學品有限公司）；酒石酸（天津市北方天醫化學試劑廠）；PVP-K30（國藥集團化學試劑有限公司）；蘋果酸（天津市瑞金特化學品有限公司）；甘露醇（天津市永大化學試劑有限公司）；所有化學試劑均為分析純，試驗用水為娃哈哈純凈水。

1.2 儀器與設備

TDP-6單沖壓片機（上海天峰制藥設備有限公司）；RE-3000A旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵（鞏義市予華儀器責任有限公司）；KQ300VDE數控超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；TU-1950紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；FA2004N電子分析天平（上海精密科學儀器有限公司）；DZF-6050真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；SY-3D片劑四用測定儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）；1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），包括四元低壓梯度泵、在線真空脫氣機、DAD檢測器、Chemstation色譜工作站。

1.3 試驗部分

1.3.1 羅布麻總黃酮提取物的制備

稱取適量羅布麻葉，粉碎，過60目篩，置于2 000 mL圓底燒瓶中，按1∶15（g/mL）料液比加入適量無水乙醇，回流脫脂4 h，過濾，用適量水洗濾渣，干燥，重新置于2 000 mL圓底燒瓶中，按料液比1∶15（g/mL）加入體積分數60%的乙醇，回流提取2次，時間分別為3和2 h，合并兩次濾液，減壓回收乙醇，得羅布麻粗提液，并以水為溶劑進行稀釋，以0.8 mL/min流速通過AB-8大孔樹脂柱，在以水為洗脫劑洗脫至無色時，改用70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫部分，回收溶劑，水浴蒸干，真空干燥，研磨，即得羅布麻總黃酮提取物（金絲桃苷含量為5.84%）。

1.3.2 羅布麻總黃酮泡騰片的制備

采用酸堿分開制粒的方法制備泡騰片，將檸檬酸、總黃酮提取物、乳糖（填充劑）、甘露醇（甜味劑）分別研碎、混合，以PVP-k30的乙醇溶液為粘合劑，制軟材，過16目篩制酸粒；將碳酸氫鈉、總黃酮提取物、乳糖、甘露醇分別研碎、混合，以PVP-k30的乙醇溶液為粘合劑，制軟材，過16目篩制堿粒。將酸粒、堿粒分別干燥后混合均勻，加入潤滑劑PEG-6000，混合均勻，壓片。

1.3.3 羅布麻總黃酮泡騰片質量評價

片重差異的測定：取20片該品，精密稱定總質量和每片的質量，經每片質量與平均質量比較，即可得出羅布麻總黃酮泡騰片的片重差異。

硬度的測定：隨機取6 片泡騰片，分別放入SY-3D片劑四用測定儀中的壓板之間，開動機器，沿徑向方向緩緩加壓，片劑剛好碎裂時的力即為泡騰片的硬度，計算平均值。

脆碎度的測定：隨機取10片泡騰片，精密稱定質量，置于SY-3D片劑四用測定儀塑料圓筒內，開動機器，以25 r/min速度轉動4 min，取出，用吹風機吹去片劑表面脫落的粉末，精密稱重，計算減失質量比。

崩解時限的測定：取1片泡騰片，置于250 mL燒杯（內有200 mL溫度20±5 ℃的水）中，即有許多氣泡放出，當片劑或碎片周圍的氣體停止逸出時，片劑應溶解或分散在水中，無聚集的顆粒剩留，同法再取6片進行檢查，各片均應在5 min內崩解。

發泡量的測定：取10支25 mL具塞刻度試管，每支試管加2.0 mL蒸餾水，置37±1 ℃水浴中5 min，各管中分別投入1片羅布麻總黃酮泡騰片，20 min內觀察最大發泡量的體積，平均發泡體積不得少于6 mL。

pH的測定：泡騰片6片，分別置于6個100 mL燒杯（內有50 mL溫度為20±5 ℃蒸餾水）中，使其發泡溶解，帶氣泡消失后，攪拌均勻測定各溶液pH，計算平均值。

泡騰片中金絲桃苷含量的測定：定量精密稱取金絲桃苷，制成質量濃度為0.18 mg/mL的對照品溶液，精密吸取0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL金絲桃苷對照品溶液，置于2 mL容量瓶中，分別得到濃度為18，36，54，72和90 μg/mL的對照品溶液，分別精密吸取上述濃度的對照品溶液，注入液相色譜儀，按色譜條件進行分析：采用色譜柱ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈（含1%冰乙酸，B）-水溶液（含0.4%磷酸，D），梯度洗脫程序：0～15 min，5%～10% B；15～20 min，10%～11% B；20～35 min，11%～15% B；35～42 min，15%～16%；42～50 min，16%～33% B；50～55 min，33%～90% B；55～60 min，90% B，柱溫55 ℃，體積流量0.8 mL/min，檢測波長360 nm，定量環進樣10 μL，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標（Y），對照品質量濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線。另隨機取3批自制羅布麻總黃酮泡騰片，每批10片，研碎，精密稱取2.0 g粉末，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入30 mL 60%乙醇，超聲處理20 min后離心（10 000 r/min），取上清液置于50 mL容量瓶中，定容，即得供試品溶液，后經0.45 μm微孔濾膜過濾，按標準曲線繪制方法測定金絲桃苷含量。

1.3.4 泡騰片的感官評價

泡騰片的口感、溶解效果、產品外觀采用感官評價，評分標準如表1所示。具體評價過程采用盲樣評價法，即選取20名接受過感官評價訓練的志愿者組成感官評價小組，隨機抽取泡騰片樣品，進行沖調，并對沖調后飲品的口感、溶解效果、產品外觀進行評分[9,11]。感官評分=口感（40%）+外觀（30%）+溶解效果（30%）。

表1 羅布麻總黃酮泡騰片評分標準

1.3.5 泡騰片制備工藝的單因素試驗

羅布麻茶收載于《中國藥典》2015年版一部，規定每袋（3.0 g）含羅布麻葉以金絲桃苷計不得少于6.0 mg，參照此標準，結合自制泡騰片的質量（規格：1.0 g/片），模擬計算可知，固定羅布麻總黃酮提取物在處方中的比例10.5%，每1片泡騰片可相當于1袋羅布麻茶來使用。在前期工作基礎上，分別選擇了檸檬酸為酸源、碳酸氫鈉為堿源、乳糖為填充劑、PEG 6000為潤滑劑，為優化泡騰片的制備工藝，固定羅布麻總黃酮提取物在片劑中的比例為10.5%，以感官評分作為評價指標，探索酸堿總用量（30%，35%，40%，45%和50%）、酸堿配比（檸檬酸與碳酸氫鈉質量比0.8∶1，1∶1，1.2∶1，1.4∶1和1.6∶1）、PEG 6000的用量（3%，4%，5%，6%和7%）對羅布麻總黃酮泡騰片質量的影響。

1.3.6 泡騰片制備工藝的響應面試驗

在單因素試驗結果基礎上，根據BBD原理，選取酸堿總用量（X1）、酸堿配比（X2）、PEG 6000用量（X3）三個因素作為變量，以感官評價為評分（Y）為因變量設計響應面試驗，試驗設計的因素及水平編碼值如表2所示。

表2 泡騰片制備工藝優化響應面試驗因素與水平

1.3.7 羅布麻總黃酮泡騰片抗氧化活性

維生素C儲備溶液的配制：精密稱取0.008 2 g維生素C（VC）置于100 mL棕色容量瓶中，以無水甲醇為溶劑定容，搖勻，即得質量濃度為82 μg/mL的VC儲備液，于4 ℃保存備用。

DPPH儲備溶液的配制：精密稱取0.055 0 g DPPH，置于250 mL棕色容量瓶中，加入無水甲醇溶解，定容，搖勻，即得質量濃度為0.22 mg/mL的DPPH溶液，于4 ℃避光保存。

DPPH清除自由基能力的測定：取2片泡騰片樣品，投入10 mL水中，待完全溶解后，轉移至25 mL容量瓶中，定容，得到質量濃度為8.4 mg/mL（以羅布麻總黃酮提取物在溶液中濃度計）的供試溶液，分別吸取0.2，0.6，1.2，1.6，2.0和2.5 mL供試溶液，置于10 mL棕色容量瓶中，分別加入1.5 mL DPPH儲備液，分別加入無水甲醇稀釋，定容，搖勻，避光反應30 min，于515 nm測定吸光度Ai（供試溶液+DPPH溶液+無水甲醇）；不加供試溶液按同樣方法測定A0（DPPH溶液+無水甲醇）；不加DPPH儲備液按同樣方法測定Aj（供試溶液+無水甲醇）。按式（1）計算樣品對DPPH自由基的清除率CLS，以提取液濃度為橫坐標，清除率為縱坐標進行曲線擬合[12]，根據回歸方程計算半數清除濃度（IC50）。

精密量取1 mL VC儲備液，置于5 mL容量瓶中，無水甲醇稀釋定容，分別精密吸取0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL稀釋后的VC溶液，置于10 mL棕色容量瓶中，按樣品DPPH清除自由基能力測定方法測得Ai'（VC溶液+DPPH溶液+無水甲醇）、A0'值（DPPH溶液+無水甲醇）、Aj'值（VC溶液+無水甲醇），按式（2）計算VC對DPPH自由基的清除率CLc，以提取液濃度為橫坐標，清除率為縱坐標進行曲線擬合，根據回歸方程計算VC的IC50值。

1.3.8 數據的分析處理

使用SPSS 22.0軟件對試驗結果進行統計分析，使用Minitab 16.3軟件進行響應面試驗設計，使用Origin 2016軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 AVET中金絲桃苷含量的測定

按1.3.3項下方法分別進樣對照品溶液和供試品溶液，色譜圖如圖1所示，其中1號峰為金絲桃苷。

圖1 金絲桃苷對照品（A）和AVET供試品（B）色譜圖

以金絲桃苷對照品的濃度（X）為橫坐標，以峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得方程Y=2 344X-2.140 8（R2=0.999 9），羅布麻總黃酮泡騰片中金絲桃苷含量測定結果如表3所示。

表3 3批羅布麻總黃酮泡騰片中金絲桃苷含量測定結果

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 酸堿總用量對感官評分的影響

從圖2可以看出，當酸堿總用量為30%～40%時，感官評分隨酸堿總用量增大而升高；當酸堿總用量達到40%時，感官評分最大，為4.35分；當酸堿總用量＞40%后，感官評分開始逐漸降低，可能是酸堿總用量增加后，泡騰片的口感偏酸所致。因此選擇酸堿總用量30%，40%和50%進行響應面試驗。

2.2.2 酸堿配比對感官評分的影響

從圖3可以看出，當酸堿配比為0.8∶1～1.2∶1時，感官評分隨酸堿配比增大而升高；當酸堿配比達到1.2∶1時，感官評分最大，為4.38分；當酸堿配比＞1.2∶1后，感官評分開始逐漸降低，可能是酸堿配比增加后，處方中檸檬酸的量相對增多，影響了泡騰片的口感和溶解性所致。因此選擇酸堿配比1∶1，1.2∶1和1.4∶1進行響應面試驗。

圖2 酸堿總用量對感官評分的影響

圖3 酸堿配比對感官評分的影響

2.2.3 PEG 6000用量對感官評分的影響

從圖4可以看出，當PEG 6000用量為3%～6%時，感官評分隨PEG 6000用量增大而增大；當PEG 6000用量達到6%時，感官評分最大，為4.25分；當PEG 6000用量＞6%后，感官評分略有下降，可能是PEG 6000用量過少，壓片易黏沖，影響泡騰片的外觀，而PEG 6000用量過大，影響泡騰片在水中的溶解性。因此選擇PEG 6000用量5%，6%和7%進行響應面試驗。

圖4 PEG 6000用量對感官評分的影響

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗分析

利用Minitab 16.3軟件對表4中數據進行分析處理，得到以Y為因變量，X1、X2、X3為自變量的三元二次方程：Y=-59.935+1.662X1+16.668X2+7.667X3+0.295X1X2-0.054 5X1X3-0.450X2X3-0.021 7X12-11.481X22-0.407X32，對此模型進行方差分析及顯著性檢驗，結果見表5。

表4 響應面試驗設計及結果

表5 回歸模型方差分析

從表5可以看出，回歸模型的p=0.000 4，顯著性分析結果為極顯著（p＜0.01）；失擬項的p=0.523 3＞0.05，說明模型的擬合程度良好，影響擬合的因素對試驗結果干擾很小；方程決定系數R=0.863 2，說明響應值的變化有86.32%來源于所選變量，由此反映出回歸模型的擬合程度良好，試驗誤差小，可用該回歸方程代替試驗實際值進行分析和預測泡騰片的感官評分值。從表5還可看出，X1、X2、X1X2、X1X3項對感官評分值影響顯著（p＜0.05），X12、X22、X32對試驗結果影響極顯著（p＜0.01），而其他線性項和交互項影響則不顯著（p＞0.05），由此反映試驗選定的各因素對響應值的影響不是簡單的線性關系。

2.3.2 響應曲面分析

為了更加清晰表達兩個因素的交互作用對泡騰片感官評分的影響，在固定X1、X2、X3中任意一個因素的值為零水平對應實際值的基礎上，考慮另外兩個因素對感官評分的影響，根據回歸模型繪制響應曲面圖和等高線圖[13-14]，結果如圖5所示。

從圖5可以看出，酸堿總量、酸堿比例對感官評分值影響比較明顯，而酸堿總量和酸堿比例、酸堿用量和PEG 6000用量之間的交互作用對試驗結果影響也比較顯著，這與表5的方差分析結果相吻合。

圖5 兩因素交互作用對感官評分值影響的響應曲面和等高線圖

利用Minitab軟件同時得到回歸模型優化的泡騰片最佳制備工藝參數：酸堿總用量37.88%、酸堿配比1.16∶1、PEG 6000用量6%，羅布麻總黃酮泡騰片感官評分為4.64%。考慮到實際生產的可操作性，將上述工藝參數修正為：酸堿總用量38%、酸堿配比1.16∶1、PEG 6000用量6%。在此工藝條件下，重復3次平行驗證試驗，羅布麻總黃酮泡騰片感官評分為4.61%，實際感官評分與理論感官評分的差值僅占理論提取率的0.65%，說明由模型方程優化的最佳工藝條件穩定可靠。

2.4 羅布麻總黃酮泡騰片質量評價

按照《中國藥典》的要求檢查泡騰片的各項指標。制得的AVET外觀光滑均勻，平均片重1.0±0.04 g，未發現片重超過規定限度，崩解時限均在5 min以內，所得溶液呈弱酸性，每片泡騰片發泡量10.4±0.18 mL，脆碎度0.81%±0.04%，每片泡騰片中金絲桃苷含量為56.1±0.26 mg/片。

2.5 抗氧化試驗結果

由圖6可知，AVET對DPPH自由基有明顯的清除作用，且隨樣品質量濃度的加大清除率呈上升趨勢，當質量濃度為0.504 mg·mL-1時，AVET對DPPH自由基清除率達到55.01%，但AVET對DPPH自由基清除率低于同濃度的VC。分別對AVET和VC濃度與清除率進行曲線回歸，得方程：Y（ATB）=31.63lnX+108.21（R2=0.983 9），Y（VC）=52.02lnX+78.53（R2=0.979 7）。通過計算可求得AVET和VC對DPPH自由基的IC50分別為0.010 7和0.007 3 mg·mL-1，表明AVET對DPPH自由基清除能力弱于VC。

圖6 羅布麻總黃酮泡騰片和VC對DPPH自由基的清除能力的影響

3 結論

此次試驗以羅布麻總黃酮為原料，旨在制備攜帶方便、口感好、容易吸收的泡騰片。通過單因素試驗結合響應面的方法，以產品外觀、口感、溶解性能作為重要考察指標，采取綜合評分法，對泡騰片的制備工藝進行優化，及原輔料用量進行優化，最終確定酸堿總用量38%、酸堿配比1.16∶1、PEG 6000用量6%，在此條件下制得泡騰片外觀光滑均勻，酸甜適中，口感柔和可口，反應劇烈，崩解迅速，溶解性能良好，綜合評分為4.61分。泡騰片的片重差異、硬度、脆碎度、崩解時限、pH、發泡量等指標均符合規定。此外，此次試驗還對AVET的體外抗氧化活性進行了研究，結果表明AVET具有體外抗氧化活性，但抗氧化能力要弱于維生素C，研究結果對于更好地開發利用羅布麻資源提供重要的依據。