超聲輔助酶解大米多肽對(duì)酵母細(xì)胞活性及耐凍性的影響

李素云，覃穎泉，謝冬梅，張華，李星科，王語遲

鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院（鄭州 450002）

冷凍面團(tuán)技術(shù)是應(yīng)用在面食制品生產(chǎn)的新工藝，因其不僅能延長(zhǎng)面食制品的貯藏時(shí)間，還能提高面食制品制作的方便和貯藏穩(wěn)定性，所以發(fā)展迅速。但冷凍后的面食制品會(huì)出現(xiàn)一定程度的品質(zhì)變化，這是因?yàn)樵诶鋬鲞^程中，酵母菌細(xì)胞內(nèi)外水分凍結(jié)成冰，冰晶生長(zhǎng)會(huì)破壞酵母細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，同時(shí)酵母胞內(nèi)水分變化會(huì)發(fā)生電解質(zhì)濃縮效應(yīng)，影響細(xì)胞的生理功能和代謝功能，直接對(duì)酵母菌造成機(jī)械傷害[1-2]，從而導(dǎo)致冷凍后饅頭體積變小、醒發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)等問題，這嚴(yán)重制約冷凍面團(tuán)制品發(fā)展[3-4]。因此，對(duì)于酵母細(xì)胞耐凍性增強(qiáng)和活性保護(hù)成為冷凍面團(tuán)研究的主要問題[5]。

前期研究表明，在相同酶解時(shí)間內(nèi)，超聲輔助酶解的大米多肽（RP）培養(yǎng)基中得到的酵母細(xì)胞量比未超聲培養(yǎng)基中得到的酵母細(xì)胞量多，證明大米多肽可以促進(jìn)酵母細(xì)胞增殖，且與多肽分子量大小有關(guān)。因此試驗(yàn)以葡萄糖作為碳源，在酵母培養(yǎng)基中用超聲輔助酶解制取的大米多肽、酪蛋白胨及酵母氮源作為氮源進(jìn)行比較，進(jìn)一步研究大米多肽對(duì)酵母增殖、發(fā)酵活性及耐凍性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

大米多肽（RP，制備具體參數(shù)為：超聲功率密度51.8 W/L、超聲溫度50 ℃、超聲時(shí)間15 min；大米蛋白溶液濃度40 g/L，酶添加量[E]/[S]=6%，溶液溫度50 ℃、pH 8.5，酶解100 min后滅酶、上清液凍干）；酪蛋白胨；酵母氮源；葡萄糖（分析純）；安琪干酵母；酵母浸粉；蛋白胨；瓊脂粉。

1.2 主要儀器與設(shè)備

離心機(jī)；低溫冰箱；可見/紫外分光光度計(jì)；立式壓力蒸汽滅菌器；超凈工作臺(tái)；生化培養(yǎng)箱；恒溫振蕩器。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的確定

YNB培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖、6.7 g/L YNB（酵母氮源基礎(chǔ)）、pH 5.5；大米多肽培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖、10～30 g/L RP（大米多肽）、pH 5.5；25 g/L CP培養(yǎng)基：20 g/L葡萄糖、25 g/L CP（酪蛋白胨）、pH 5.5；YPD培養(yǎng)基：10 g/L酵母浸粉、20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨（固體培養(yǎng)基加20 g/L瓊脂粉）。YNB培養(yǎng)基用0.22 μm濾膜過濾除菌，其他培養(yǎng)基121 ℃、15 min高溫高壓滅菌；酵母細(xì)胞培養(yǎng)在100 mL培養(yǎng)基中，安琪酵母經(jīng)2代活化后以1%接種量接菌于培養(yǎng)基，于30 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h。

1.3.2 酵母細(xì)胞的收集及濕質(zhì)量測(cè)定

將培養(yǎng)24 h后的菌液分裝到提前稱質(zhì)量并記錄好質(zhì)量（m1，g）的50 mL離心管，使用離心機(jī)離心得到酵母細(xì)胞。離心條件為：轉(zhuǎn)速4 000 r/min、離心時(shí)間10 min。離心后菌液下層沉淀即為所需的酵母細(xì)胞，舍去上清液，稱定離心管質(zhì)量（m2，g），m2與m1的差即為所得酵母細(xì)胞的濕質(zhì)量。

1.3.3 發(fā)酵面團(tuán)制備、發(fā)酵過程測(cè)定及蒸制

將離心后得到的酵母細(xì)胞與42 g去離子水、75 g面粉混合成面團(tuán)，每份50 g于100 mL相同規(guī)格的小燒杯中壓平表面，一份于37 ℃直接發(fā)酵，另一份置于-18℃低溫冰箱儲(chǔ)存5 d，取出常溫解凍1 h后37 ℃發(fā)酵。面團(tuán)發(fā)酵過程中每隔15 min用直尺測(cè)面團(tuán)高度并記錄，發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵面團(tuán)于沸水入鍋蒸20 min，結(jié)束5 min后開鍋取出放涼，從中間切開觀察剖面。

1.3.4 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

為了解不同氮源培養(yǎng)基對(duì)酵母增殖的影響，將經(jīng)2代活化后的酵母菌液以1%接種量接菌于100 mL培養(yǎng)基中，在30 ℃下以120 r/min搖床培養(yǎng)。分別在0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，24，27，30，33和36 h時(shí)取樣，用可見/紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液吸光度，測(cè)定波長(zhǎng)600 nm。以生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌液吸光度為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.3.5 酵母細(xì)胞存活率的測(cè)定

培養(yǎng)結(jié)束后用稀釋涂布平板法對(duì)所得菌液進(jìn)行平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)，同時(shí)將菌液置于-18 ℃低溫冰箱儲(chǔ)存5 d，取出解凍1 h后用同樣的方法進(jìn)行平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)，得到冷凍前后培養(yǎng)液中酵母細(xì)胞濃度，計(jì)算存活率。

存活率=lg（冷凍后培養(yǎng)液中酵母細(xì)胞濃度）/lg（未冷凍時(shí)培養(yǎng)液中酵母細(xì)胞濃度）×100% （1）

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮源培養(yǎng)基對(duì)酵母細(xì)胞增殖的影響

由前期研究可知，培養(yǎng)基中添加25 g/L大米多肽可以獲得較好的培養(yǎng)效果。因此以25 g/L氮源濃度研究其對(duì)酵母細(xì)胞增殖影響，所以試驗(yàn)培養(yǎng)基濃度均為25 g/L。表1為不同氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母細(xì)胞離心后得到的酵母細(xì)胞濕質(zhì)量。由表1可知，大米培養(yǎng)基離心后得到的酵母細(xì)胞最多，有1.35 g；其次是CP培養(yǎng)基，離心出1.26 g酵母細(xì)胞；最后是YNB培養(yǎng)基和空白對(duì)照組。從表1的數(shù)據(jù)可證明大米多肽對(duì)于酵母細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用。

表1 不同氮源培養(yǎng)基中得到的酵母濕質(zhì)量

2.2 不同氮源培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母的生長(zhǎng)曲線

以25 g/L氮源濃度研究其對(duì)酵母細(xì)胞培養(yǎng)過程的影響，OD600nm值的大小和菌液中的細(xì)胞密度呈正比，具體結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，CP作為氮源的培養(yǎng)基在0～5 h和其他氮源培養(yǎng)基內(nèi)的酵母數(shù)量差別不大，但是于10～24 h菌液的OD600nm值增加比YNB、CP的快，且酵母的對(duì)數(shù)期時(shí)間較長(zhǎng)。因此大米多肽作為氮源培養(yǎng)基最終得到更多酵母細(xì)胞，證明大米多肽能促進(jìn)酵母細(xì)胞增殖。

圖1 不同氮源培養(yǎng)基中酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

2.3 大米多肽培養(yǎng)基對(duì)面團(tuán)中酵母細(xì)胞發(fā)酵活性的影響

在相同大小的燒杯中，通過測(cè)量面團(tuán)的發(fā)酵高度的增長(zhǎng)表示面團(tuán)中酵母細(xì)胞的發(fā)酵力。圖2為3種不同氮源的培養(yǎng)基所得酵母發(fā)酵面團(tuán)高度。

由圖2可知，與CP和YNB培養(yǎng)基中所得酵母細(xì)胞發(fā)酵的面團(tuán)能力相比，RP培養(yǎng)基中所得酵母細(xì)胞發(fā)酵的面團(tuán)最先達(dá)到發(fā)酵終點(diǎn)，約120 min，且此時(shí)面團(tuán)增長(zhǎng)高度約是YNB面團(tuán)的1.02倍、CP面團(tuán)的1.7倍，表明以大米多肽作為培養(yǎng)基氮源培養(yǎng)酵母細(xì)胞在面團(tuán)中具有更好發(fā)酵力。

對(duì)于冷凍面團(tuán)，由圖2可以看出，大米多肽培養(yǎng)基面團(tuán)能更快進(jìn)入發(fā)酵狀態(tài)，發(fā)酵力保持仍然很好，210 min時(shí)大米多肽培養(yǎng)基面團(tuán)增長(zhǎng)高度約是YNB培養(yǎng)基面團(tuán)的2.9倍，是CP培養(yǎng)基面團(tuán)的9.6倍。因此大米多肽培養(yǎng)得到的酵母細(xì)胞在冷凍后的發(fā)酵面團(tuán)中也能夠較好地保持發(fā)酵力。

圖2 不同氮源培養(yǎng)所得酵母發(fā)酵面團(tuán)高度

圖3 是不同時(shí)間面團(tuán)發(fā)酵的照片記錄，可看到60 min時(shí)各個(gè)面團(tuán)的發(fā)酵程度相差比較明顯，未冷凍的發(fā)酵面團(tuán)隨發(fā)酵的進(jìn)行高度差距逐漸減小，而以大米多肽作為培養(yǎng)基培養(yǎng)的酵母添加到面團(tuán)冷凍后發(fā)酵高度始終明顯高于其他兩種面團(tuán)。結(jié)合圖2，冷凍后面團(tuán)發(fā)酵過程中的高度變化表明，冷凍后大米多肽培養(yǎng)基培養(yǎng)的酵母細(xì)胞在面團(tuán)中能夠保持較高的發(fā)酵力，用大米多肽作為培養(yǎng)基氮源培養(yǎng)酵母細(xì)胞在面團(tuán)冷凍過程中發(fā)酵力的損失較少。發(fā)酵結(jié)束面團(tuán)蒸制后切面照片如圖4所示。對(duì)于未經(jīng)冷凍的面團(tuán)蒸制的饅頭，大米多肽培養(yǎng)基饅頭內(nèi)部氣孔細(xì)密均勻；CP培養(yǎng)基、YNB培養(yǎng)基和空白組饅頭內(nèi)部氣孔相較之下不夠均勻，存在較多大氣孔。對(duì)于面團(tuán)冷凍5 d后蒸制的饅頭，大米多肽饅頭內(nèi)部氣孔與未經(jīng)凍藏相比變化較小，但CP、YNB培養(yǎng)基和空白組饅頭內(nèi)部氣孔都變小很多，表示相應(yīng)發(fā)酵力很小。

2.4 發(fā)酵面團(tuán)中添加大米多肽方式對(duì)酵母細(xì)胞發(fā)酵活性的影響

大米多肽作為培養(yǎng)基氮源來培養(yǎng)酵母細(xì)胞添加在普通面團(tuán)和冷凍面團(tuán)中均有顯著效果，將大米多肽直接添加到面團(tuán)中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵面團(tuán)的高度變化曲線如圖5所示。大米多肽直接添加到面粉里進(jìn)行發(fā)酵，在初始階段發(fā)酵力比大米蛋白作為培養(yǎng)基的效果要好，但是120 min后大米蛋白作為培養(yǎng)基的效果要好于直接添加到面粉里的，同時(shí)冷凍后的面團(tuán)具有相同趨勢(shì)。原因有可能是多肽作為培養(yǎng)基氮源培養(yǎng)得到更多酵母細(xì)胞，同時(shí)這些酵母細(xì)胞還具有更好的耐凍性，研究結(jié)果與Izawa等[6]相同。

圖3 冷凍和未冷凍面團(tuán)在不同發(fā)酵時(shí)間的照片記錄（從左到右為RP，CP，YNB）

圖4 發(fā)酵結(jié)束蒸制后的照片記錄

圖5 發(fā)酵面團(tuán)中添加大米多肽方式對(duì)酵母細(xì)胞發(fā)酵活性的影響

2.5 不同氮源培養(yǎng)對(duì)酵母細(xì)胞耐凍性的影響

為探究大米多肽對(duì)酵母細(xì)胞耐凍性的影響，不同培養(yǎng)基中酵母細(xì)胞冷凍前后的細(xì)胞存活率如圖6所示。RP培養(yǎng)基里的酵母存活率最高，YNB次之，CP培養(yǎng)基里的酵母存活率最低。大米多肽培養(yǎng)基培養(yǎng)的酵母細(xì)胞冷凍后存活率明顯高于CP培養(yǎng)基培養(yǎng)的酵母細(xì)胞，比CP培養(yǎng)基里的酵母細(xì)胞存活率高約34.58%，表明大米多肽對(duì)增強(qiáng)酵母細(xì)胞的耐凍性有一定影響，可減少冷凍導(dǎo)致的細(xì)胞失活。

圖6 冷凍前后不同培養(yǎng)基中的酵母細(xì)胞存活率

3 結(jié)果與討論

用不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母細(xì)胞對(duì)酵母細(xì)胞的增殖、發(fā)酵活力及耐凍性有不同影響。由試驗(yàn)可得到如下結(jié)論：

1) 大米多肽對(duì)于酵母細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用。大米多肽、CP和YNB這3種培養(yǎng)基中，大米多肽培養(yǎng)基培養(yǎng)的酵母細(xì)胞增殖最多。

2) 與酵母氮源及酪蛋白胨相比，以大米多肽作為氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)酵母，在普通發(fā)酵面團(tuán)及冷凍發(fā)酵面團(tuán)中具有更好的發(fā)酵力。

3) 在面團(tuán)中直接添加大米多肽對(duì)普通發(fā)酵面團(tuán)及冷凍發(fā)酵面團(tuán)都沒有顯著的效果，因此大米多肽對(duì)于酵母細(xì)胞增殖影響主要作用在酵母細(xì)胞的培養(yǎng)過程而不是發(fā)酵過程。

大米多肽在酵母細(xì)胞的培養(yǎng)過程中，促進(jìn)酵母細(xì)胞的增殖，使酵母細(xì)胞的耐凍性增強(qiáng)，改善了冷凍面團(tuán)的發(fā)酵性能。大米多肽作為一種本身可食用的功能性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)應(yīng)用于培養(yǎng)基，與基因手段等方法相比更加簡(jiǎn)便高效且安全，應(yīng)用于酵母細(xì)胞制備和冷凍面團(tuán)中也更容易被消費(fèi)者所接受，能擴(kuò)大大米多肽的應(yīng)用范圍。