pCEC法檢測無糖型運動營養(yǎng)品中5種糖醇

張迪，劉木子，胡穎

1.秦皇島職業(yè)技術(shù)學(xué)院（秦皇島 066100）；2.南京信息職業(yè)技術(shù)學(xué)院（南京 210000）；3.山西建筑職業(yè)技術(shù)學(xué)院（太原 030006）

運動營養(yǎng)品是為了滿足運動人群在運動后的生理代謝需求、緩解運動疲勞而加工生產(chǎn)的具有豐富營養(yǎng)元素的特殊食品。運動營養(yǎng)品的種類很多，其中就有針對不能攝入糖分人群的無糖型運動營養(yǎng)品，此類產(chǎn)品中的糖替代品一般選擇糖醇[1-2]。糖醇不僅具有糖的甜味，而且被人體攝入后，無需胰島素調(diào)節(jié)，血糖含量不會產(chǎn)生波動，因此糖醇作為糖替代品制作的無糖運動營養(yǎng)品非常適合不能攝入糖分的人群食用[3-4]。市場上這類無糖型運動營養(yǎng)品較受歡迎，但相關(guān)產(chǎn)品的標準及檢測方法相對滯后，這給這類產(chǎn)品的質(zhì)量判定及監(jiān)管帶來不便。

糖醇的檢測方法有高效液相色譜法[5-10]和氣相色譜法[11-13]。氣相色譜法檢測前需進行衍生化處理，試驗步驟冗長、重現(xiàn)性不好。高效液相色譜法中，結(jié)合蒸發(fā)光散射器的優(yōu)點，樣品無需衍生直接檢測，試驗操作簡單。加壓毛細管電色譜（pCEC）技術(shù)是一種結(jié)合毛細管電泳的高柱效及高效液相色譜的高選擇性的新型電動微分離技術(shù)[14-16]，更適合復(fù)雜樣品的多組分檢測。試驗將加壓毛細管電色譜雙重分離機理與蒸發(fā)光散射檢測器的優(yōu)點相結(jié)合，開發(fā)無糖型運動營養(yǎng)品中5種糖醇的分析檢測新方法。該方法操作簡單、分析速度快，對此類產(chǎn)品中糖醇的測定方法體系形成有效補充。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

2100型加壓毛細管電色譜系統(tǒng)（美國賽默飛公司）；Sedex 75型蒸發(fā)光散射檢測器（美國賽默飛公司）。

木糖醇、山梨糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、赤蘚糖醇標準品（國家標準物質(zhì)中心）；乙腈、乙醇（色譜純）。

1.2 樣品來源

樣品均為隨機購買市場上銷售的無糖型運動營養(yǎng)品。

1.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX糖分析色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速1.2 mL/min；進樣量10 μL；柱溫30 ℃。

1.4 試驗方法

參考相關(guān)文獻中糖醇的分離條件，以乙腈-水為流動相，采用親水作用毛細管電色譜柱進行5種糖醇的分離。通過對流動相添加劑體系、電壓強度分離條件的優(yōu)化，以及ELSD蒸發(fā)管溫度、載氣流速檢測條件的選擇，確定加壓毛細管電色譜條件。

1.4.1 流動相體系對糖醇色譜行為的影響

試驗以流動相[V（乙腈）∶V（水）=80∶20]為基礎(chǔ)，在流動相中分別加入10 mmol/L甲酸、三乙胺、乙酸-乙酸銨和三乙胺-甲酸（等摩爾添加），考察5種糖醇在不同流動相添加體系的分離情況和信噪比。

1.4.2 電壓強度對糖醇色譜行為的影響

電壓是加壓毛細管電色譜試驗條件中一個重要的試驗參數(shù)，施加不同的電壓強度對樣品的分離能力和分離速度會產(chǎn)生不同影響，試驗分別施加0，2，4，5和8 kV正向電壓，考察5種糖醇在電壓強度的分離情況。

1.4.3 蒸發(fā)光散射檢測器條件的優(yōu)化

影響蒸發(fā)光散射檢測器的兩個重要的參數(shù)分別是蒸發(fā)管溫度和載氣流速，兩者對色譜圖的信噪比（S/N）影響較大，一般建立適當?shù)恼舭l(fā)光散射檢測方法時，需對這2個參數(shù)進行優(yōu)化。

1.4.4 標準曲線的制作

稱取相應(yīng)質(zhì)量的木糖醇、山梨糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、赤蘚糖醇標準品，配制成質(zhì)量濃度為0.005，0.010，0.020，0.040，0.060和0.100 g/100 mL的標準溶液，進儀器分析，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.4.5 樣品的前處理

無糖型運動營養(yǎng)品中營養(yǎng)元素較多，食品基質(zhì)較復(fù)雜，按照GB 5009.279—2016中方法進行前處理，會出現(xiàn)一定的不適用性，基質(zhì)影響較大，檢測譜圖中目標組分易被雜質(zhì)成分干擾，試驗針對此類樣品進行前處理優(yōu)化，進一步消除此類樣品中的雜質(zhì)干擾。具體步驟：稱取2.00 g樣品置于25 mL離心管中，加入30℃溫水定容，搖勻后超聲10 min，以5 000 r/min離心5 min。取10 mL上清液于25 mL離心管中，加入2 mL提取液后搖勻靜置10 min，以5 000 r/min離心5 min，取全部上清液，加入水定容到20 mL，搖勻后取850 μL濾液，加入150 μL碳酸鈉溶液，搖勻中和后上機檢測。試驗比較三氯乙酸、乙腈、乙醇3種不同提取液對5種糖醇檢測的影響。

1.4.6 方法的精密度、重復(fù)性與回收率

以未檢出5種糖醇的運動營養(yǎng)品為空白基質(zhì)，加入不同濃度的木糖醇、山梨糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、赤蘚糖醇混合標準溶液，使用優(yōu)化后的前處理方法提取，上機檢測，計算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相體系對糖分色譜行為的影響

試驗發(fā)現(xiàn)，5種糖醇的分離情況未有明顯變化；但信噪比差異明顯，其信噪比在不同添加體系下的變化如圖1所示。

結(jié)果表明，三乙胺-甲酸添加體系的信噪比最高，這種添加劑可以形成離子對，可有效提高糖醇顆粒大小，從而提高散射光強度。另外，流動相添加三乙胺時信噪比有明顯提高，與添加三乙胺-甲酸時相差并不大，而且在堿性環(huán)境下更利于產(chǎn)生電滲流，故選擇三乙胺作為流動相添加劑。

圖1 不同流動相體系對5種糖醇信噪比的影響

2.2 電壓強度的選擇

在流動相中加入10 mmol/L三乙胺，分別施加0，2，4，5和8 kV正向電壓，結(jié)果如圖2所示。

結(jié)果表明，隨著電壓的升高，在電滲流的推動下5種糖醇的分離速度明顯加快，同時色譜峰形變窄；施加電壓+5 kV時，樣品分離時間加快到14 min左右，并且5種糖醇樣品完全分離。施加電壓達到+8 kV后，分離速度無明顯加快，并且儀器電流急劇增大，故選擇施加電壓+5 kV。

2.3 載氣流速的選擇

較低的載氣流速有利于提高ELSD的檢測靈敏度，試驗在較低載氣流速范圍內(nèi)進行最佳氣體流速考察。分別在載氣流速為0.5，0.6，0.8，1.0和1.2 L/min條件下，考察5種糖醇的信噪比，結(jié)果如圖3所示。

結(jié)果表明，當載氣流速低于0.8 L/min時，糖醇樣品的色譜峰開始明顯展寬，影響到樣品分離度，信噪比也均出現(xiàn)下降趨勢。過低的氣體流速會降低樣品霧化效率，基線噪聲變大，色譜峰展寬嚴重，從而使信噪比降低，故選擇最佳載氣流速0.8 L/min。

圖2 電壓強度對5種糖醇分離速度的影響

圖3 載氣流速對5種糖醇信噪比的影響

2.4 蒸發(fā)管溫度的選擇

在優(yōu)化試驗條件下，分別考察5種糖醇在蒸發(fā)管溫度90，100，110，120和130 ℃時的信噪比，結(jié)果如圖4所示。

結(jié)果表明，山梨糖醇、麥芽糖醇和乳糖醇隨著蒸發(fā)管溫度的升高，其信噪比保持上升趨勢；木糖醇信噪比在蒸發(fā)管溫度超過110 ℃時開始下降，山梨糖醇信噪比在蒸發(fā)管溫度超過120 ℃時開始下降。綜合考慮，以信噪比較低的乳糖醇和赤蘚糖醇為主要優(yōu)化對象，故選擇最佳蒸發(fā)管溫度120 ℃。

圖4 蒸發(fā)管溫度對5種糖醇信噪比的影響

在優(yōu)化后條件下檢測含有木糖醇的無糖型運動營養(yǎng)品，如圖5所示。

圖5 無糖型運動營養(yǎng)品的pCEC分離譜圖

2.5 標準曲線的制作

為驗證5種糖醇在80%乙腈-水（含10 mmol/L三乙胺）流動相體系中的線性關(guān)系，配制木糖醇、山梨糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇和赤蘚糖醇濃度分別為0.005，0.010，0.020，0.040，0.060和0.100 g/100 mL的系列混合標準溶液。結(jié)果表明，5種糖醇分在0.005～0.100 g/100 mL濃度范圍內(nèi)均具有良好線性關(guān)系（r2＞0.99）；采用在空白基質(zhì)中添加目標組分的方法，依據(jù)色譜峰的信噪比大于3倍確定檢出限，信噪比大于10倍確定定量限，得到5種目標組分的檢出限和定量限，分別為0.5～1.0和1.5～3.0 mg/100 mL，結(jié)果見表1。

表1 5種糖醇的保留時間、標準曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限

2.6 提取液的選擇

針對于樣品提取液的選擇，分別選用提取液Ⅰ（三氯乙酸）、提取液Ⅱ（乙醇）、提取液Ⅲ（乙腈）來進行比較，以5種糖醇的回收率為比較依據(jù)，結(jié)果如圖6所示。

結(jié)果表明，提取液Ⅲ（乙腈）的提取效果最好，能將樣品溶液中的蛋白類物質(zhì)沉淀完全，除雜效果較好，5種糖醇的回收率均在85%以上，其次為乙醇和三氯乙酸，所以選擇乙腈作為提取液。

2.7 加標回收率與精密度

在加標回收試驗中，選用植物源性基質(zhì)、動物源性基質(zhì)共2種基質(zhì)的運動營養(yǎng)品，分別添加5.0，50和100 mg/100 g 低、中、高的3個水平混合標準品，每個結(jié)果測定5次，進行加標回收的試驗。

由表2可見，5種組分的3個水平的加標回收率為87.5%～102.4%，相對標準偏差為2.15%～5.23%，表明試驗所建立的方法能夠滿足檢測實際樣品需要。

圖6 提取液選擇對5種糖醇回收率的影響

表2 方法的回收率及相對標準偏差（n=5）

3 結(jié)論

利用加壓毛細管電色譜-蒸發(fā)光散射聯(lián)用法，通過對流動相體系、電壓強度、蒸發(fā)管溫度和載氣流速的優(yōu)化，以及樣品提取液的比較，建立了同時分離檢測無糖型運動營養(yǎng)品中的木糖醇、山梨糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇和赤蘚糖醇5種糖醇的親水作用電色譜法。結(jié)果表明，在V（乙腈）∶V（水）=80∶20流動相體系中添加10 mmol/L三乙胺，在電壓強度+5 kV、載氣流速0.8 L/min、蒸發(fā)管溫度120 ℃條件下，木糖醇、山梨糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、赤蘚糖醇5種組分能得到良好基線分離，其峰型良好，出峰時間合適。樣品在經(jīng)提取液乙腈的提取下，可實現(xiàn)對目標物的凈化，有效解決多組分糖醇共存時樣品前處理復(fù)雜、回收率低的分析難點，可為無糖型運動營養(yǎng)品中糖醇的分析和監(jiān)控提供技術(shù)支持。