HPLC-ABTS+·在線檢測快速評價茶葉總抗氧化能力

王丹，時志春，李軍，王金蘭，張樹軍，趙明

齊齊哈爾大學化學與化學工程學院（齊齊哈爾 161006）

茶葉為山茶科植物茶（Camellia sinensis（L.）O.Ktze.）的芽、葉，其含有豐富的茶多酚、茶多糖、維生素及礦物質等營養物質，具有抗衰老、抗腫瘤、降血糖和降血脂等[1-3]功效，是天然酚類抗氧化劑的主要來源，能有效清除自由基，抑制活性氧的形成，具有良好的抗氧化能力[4]。茶多酚是從綠茶和紅茶中提取的一種純天然復合物，具有清除自由基、防止DNA受損、調節細胞內抗氧化防御系統及抗癌等生物學功能[5]。茶多酚中以兒茶素類為主要成分，具有顯著的藥理作用，茶多酚含量占茶葉干重的30%左右[6]。近十幾年，評價和篩選具有強抗氧化活性的天然資源已成為生物學、醫學和食品科學研究的新趨勢。

物質的總的抗氧化活性是指清除不同的自由基或者物質的不同活性成分的有效和[7]。國內外常用的測定總抗氧化活性的方法有DPPH法、ABTS法、ORAC法、FRAP法等。但是這些方法對于一些大規模的分析植物樣品抗氧化活性，存在著實驗步驟較多的缺點，因此開發了HPLC-DPPH法、銅離子在線檢測（HPLC-CUPRAC）法、在線HPLC-ABTS+·法[8-10]等多種HPLC在線檢測系統，可以高效快速地分析樣品的抗氧化活性。但是這些在線檢測法的重點是確定單體化合物是否具有抗氧化活性[11-13]，利用抗氧化活性綜合指數（Antioxidant potency composite，APC）評價樣品抗氧化能力[14]，并不能直接快速地換算成標準抗氧化物質當量來表示樣品的總抗氧化能力大小，同時定性定量樣品的總抗氧化活性。為了實現在線快速檢測茶葉水提物的總抗氧化活性，此次試驗建立一種利用在線HPLC-ABTS+·檢測系統，快速高效地測定總混合物抗氧化活性的分析測定方法，并基于傳統的離線DPPH自由基清除法評價，驗證了利用在線HPLCABTS+·系統研究的實用性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶葉樣品均為市售品：花茶（福建福州）；鐵觀音（福建安溪）；綠茶（西湖龍井；信陽毛尖）。水為娃哈哈純凈水。兒茶素標準品（美國Sigma公司，純度98%以上）；ABTS（2,2′-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽）；DPPH（2,2′-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）；過硫酸鉀（上海凌峰，分析純）；無水乙醇（分析純）；甲醇（山東禹王，色譜純）。

1.2 儀器與設備

安捷倫1260在線高效液相色譜系統（配有二元梯度泵、ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）、自動進樣器、柱溫箱、光電二極管陣列 DAD檢測器）；柱后反應系統（配有柱后衍生單元泵、柱后反應線圈、三通、MWD多波長檢測器）；Chemstation數據分析工作站（美國安捷倫公司）；RE-52B旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；TGL-16G型高速離心機（江蘇金壇市中大儀器廠）；BP 310S電子天平（賽多利斯公司）；酶標儀（瑞士Tecan sunrise）。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

每個茶葉樣品經40 ℃干燥后，粉碎過60目篩，分別準確稱取2.0 g茶葉粉末于250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL純凈水，回流2 h，重復回流2次，冷卻后過濾蒸干稱重，制得的茶葉水提物于冰箱中4 ℃保存，備用。

1.3.2 溶液的配制

DPPH自由基溶液的配制：準確稱取7.5 mg DPPH粉末于20 mL無水乙醇中，配制成質量濃度為0.375 mg/mL的DPPH溶液，在4 ℃冰箱中避光保存，備用。

ABTS+·溶液的配制：采用2 mmol的ABTS水溶液和3.5 mmol的K2SO4水溶液混合，用8倍體積的娃哈哈純水稀釋，室溫避光保存，過夜后加入系統溶劑瓶中。

1.3.3 色譜條件

色譜柱為ZORBAX SB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相A為甲醇；流動相B為水；流速為1.0 mL/min；梯度洗脫：0～5 min 25% A，5～10 min 25%～30% A，10～15 min 30%～40% A，15～20 min 40% A，20～30 min 40%～70% A；進樣體積為10 μL；柱溫為25℃；檢測波長為210 nm；ABTS+·溶液流動相流速為0.5 mL/min；檢測波長為734 nm。

1.3.4 樣品抗氧化活性測定

1) HPLC-ABTS+·在線抗氧化活性測定。分別取不同茶葉提取物浸膏置于容量瓶中，配制成2.0，3.0和4.0 mg/mL甲醇溶液，離心后，用0.22 μm微孔濾膜過濾，將濾液置于棕色進樣瓶中待測。將處理后的樣品提取液按照1.3.3小節進行HPLC-ABTS+·在線系統分析，進樣量為10 μL。柱后衍生分析系統參照文獻[15]方法，ABTS+·溶液引入流速為0.5 mL/min，MWD檢測器檢測波長為734 nm。

2) DPPH自由基清除能力測定。自由基清除試驗參照文獻[16]的方法，設置2個試驗組：空白組（A0），20 μL無水乙醇+180 μL DPPH溶液；樣品組（A1），20 μL待測樣品+180 μL DPPH溶液。分別取20.0 μL配制好的不同濃度的樣品溶液至96孔板中，向其中分別加入180.0 μL的DPPH溶液，輕輕振蕩，使其充分混合，避光反應30 min，用酶標儀在517 nm檢測波長下測定各孔吸光度。各試驗組設2個平行孔，重復試驗3次。

2 結果與分析

2.1 兒茶素標準曲線

精密稱取20.0 mg兒茶素標準品，用甲醇溶解定容至10 mL棕色容量瓶中，制成2.0 mg/mL標準溶液，用甲醇逐級稀釋，制備2.0，1.5，0.75，0.375和0.062 5 mg/mL的標準溶液，并經0.22 μm微孔濾膜過濾至進樣瓶中，進樣；記錄檢測波長為734 nm的倒峰面積。

用兒茶素的質量濃度（x）與其對應的色譜倒峰面積（y）繪制標準曲線，結果見圖1。回歸方程和相關系數為：y=14 594x+2 733.8（R2=0.999 1）。兒茶素在0.062 5～2.0 mg/mL質量濃度范圍內呈良好的線性關系。經HPLC測定，以信噪比（S/N）為3和10所對應樣品中該物質的質量濃度分別計算檢限測（LOD）和定量限（LOQ），兒茶素檢測限檢出限為0.2 μg/mL，定量限為1.0 μg/mL。利用兒茶素抗氧化當量（Catechin equivalent antioxidant capacity，CEAC）換算樣品的總抗氧化活性測定值，從而實現分析樣品的總抗氧化能力。

圖1 兒茶素標準曲線

2.2 儀器精密度的考察

精密吸取10 μL 1.5 mg/mL的兒茶素對照品溶液，按上述測定條件連續進樣5次，計算得兒茶素測定結果的相對標準偏差（Relative standard deviation，RSD），為1.77%，精密度滿足方法學定量要求。

2.3 重復性試驗

精密稱取同一批次茶葉樣品，各5份，按照上述供試溶液的制備方法和測定條件，制備5份供試溶液并測定，對同一批次樣品多次取樣分析，RSD為1.98%，表明該方法具有良好的重現性。

2.4 基于HPLC-ABTS+·法測定不同茶葉提取物的總抗氧化能力分析

利用HPLC-ABTS+·系統已經測得的樣品倒峰總面積代入兒茶素建立的標準曲線方程，將不同濃度樣品抗氧化活性以兒茶素當量（Catechin equivalent antioxidant capacity，CEAC）表示，測試結果如表1所示，所得數值 CEAC 值越大，表示抗氧化能力越強。

由表1可知，由HPLC-ABTS+·法測定的4種茶葉抗氧化能力由大到小的順序依次是花茶＞西湖龍井＞信陽毛尖＞鐵觀音。其中花茶的抗氧化能力表現最強，分析結果如圖2所示；兩種綠茶類茶葉抗氧化能力相當，且均強于烏龍茶類的鐵觀音。由圖2可以看出，花茶在線系統反應后的倒峰較多且吸光度較大，鐵觀音的倒峰較少且吸光度較弱。

兒茶素是茶多酚最具生物活性的部分[17]，在發酵過程中，酚類氧化酶氧化兒茶素生成醌類，然后形成Bisflavanol、Thearubigen、茶黃素等物質[18]。隨著發酵程度的加深，兒茶素含量迅速下降。表明發酵程度越高，抗氧化能力越低，這與其他文獻報道的一致[19]。

2.5 DPPH法抗氧化活性驗證

選用兒茶素作對照品，對4種茶葉用DPPH進行抗氧化活性驗證試驗。分別稱取兒茶素及待測樣品，配制成100，80，60，40和20 μg/mL五種不同的質量濃度，將配制好的待測樣品及兒茶素加入到96孔細胞培養板的小孔中，在避光條件下再分別加入180 μL DPPH乙醇溶液到每個孔中，反應0.5 h后放入酶標儀中，96孔板反應液結果圖如圖3所示。

表1 待測樣品的抗氧化活性

圖2 花茶和鐵觀音的HPLC-ABTS+·在線抗氧化分析結果圖

圖3 不同茶葉樣品DPPH抗氧化活性試驗結果圖

由圖4可知，不同茶葉樣品的DPPH自由基清除率均隨質量濃度增加而增加，其清除能力比兒茶素略低。在517 nm的波長下測定吸光度，經計算得待測樣品及兒茶素的IC50值。由表2可以看出，在DPPH自由基的反應體系中，各種茶葉樣品對自由基的清除能力差異較大，其清除能力依次為兒茶素＞花茶＞西湖龍井＞信陽毛尖＞鐵觀音。

圖4 不同茶葉樣品對DPPH自由基清除率的影響

表2 樣品及兒茶素抗氧化活性的IC50

3 結論

HPLC-ABTS+·在線抗氧化檢測系統是指通過HPLC系統與柱后衍生系統連接起來，在線分析抗氧化活性，使樣品提取物可以隨著流動相被洗脫出來，并與另一個泵的ABTS+·自由基溶液反應，反應結果以自由基溶液色譜倒峰圖體現。倒峰總面積越大，代表被清除的自由基越多，樣品的總抗氧化活性越強。該方法樣品自動進樣，分析時間短，克服了離線抗氧化活性分析過程中操作過程繁瑣、費時費力的缺點，減少了人為操作過程對實驗結果的影響。

此次試驗以不同茶葉為研究對象，采用在線HPLC-ABTS+·法證實茶葉提取物具有一定清除自由基能力，初步計算了抗氧化活性相當于標準抗氧化物質的當量值，同時與離線DPPH法測定提取物的總抗氧化活性進行比較，大小趨勢基本一致。清除能力依次為兒茶素＞花茶＞西湖龍井＞信陽毛尖＞鐵觀音，該方法可用于植物資源總抗氧化活性系統的快速評價。