HPLC法測(cè)定新疆地區(qū)紅棗中黃酮類物質(zhì)的含量

袁輝，張煌濤，王建玲

新疆產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院（烏魯木齊 830011）

紅棗是新疆的一種特產(chǎn)，屬李科棗屬水果，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血、養(yǎng)血安神的功效；干果肉厚、皮薄、味甜、無(wú)污染的特點(diǎn)。目前，新疆紅棗種植面積和產(chǎn)量已躍居全國(guó)第一，成為新疆農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)之一[1]，新疆紅棗年產(chǎn)量超過(guò)3.00×106t，位列各省首位，屬優(yōu)勢(shì)特色農(nóng)產(chǎn)品[2]。

現(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)，紅棗含有蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、有機(jī)酸、微量元素等豐富的營(yíng)養(yǎng)成分。研究表明，包括癌癥、冠心病、高血壓、心肌梗塞在內(nèi)的40余種疾病均與人體內(nèi)環(huán)磷酸腺苷cAMP代謝相關(guān)[3]，對(duì)心臟起到營(yíng)養(yǎng)心肌、正性肌力、舒張血管、抗血小板凝聚和抗心律失常的作用。cAMP在棗中的含量是現(xiàn)在所有已測(cè)動(dòng)植物材料中最高的[4]。紅棗中的黃酮類物質(zhì)，如蘆丁、槲皮素等，具有止咳、祛痰、平喘、抗菌、抗病毒活性、抗衰老、增強(qiáng)免疫力等作用，綠原酸具有抗炎[5]、抗病毒[6]的功效。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

試驗(yàn)材料，新疆各產(chǎn)地紅棗50批次；環(huán)磷酸腺苷對(duì)照品（東京化成工業(yè)株式會(huì)社）；蘆丁、槲皮素、綠原酸對(duì)照品（德國(guó)Dr. Ehretorfer GmbH公司）；甲醇（德國(guó)默克公司）；磷酸二氫鉀等均為分析純。

2695高效液相色譜儀（美國(guó)WATERS公司）；BSA224S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；SB-800DTD超聲清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；5418離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

將紅棗樣品切成細(xì)條，放入100 ℃烘箱中烘干，然后粉碎過(guò)50目篩，備用。準(zhǔn)確稱取2 g（精確至0.000 1 g）粉碎樣品于離心管中，加入一定量的水，超聲提取30 min，冷卻至室溫后用水定容至50 mL。在4 000 r/min下離心10 min，取上清液，過(guò)0.22μm濾膜，供環(huán)磷酸腺苷待測(cè)使用。

準(zhǔn)確稱取4 g（精確至0.000 1 g）粉碎樣品于離心管中，加入一定量的30%甲醇水溶液，超聲提取30 min，冷卻至室溫后用30%甲醇水溶液定容至50 mL。在4 000 r/min下離心10 min，取上清液，過(guò)0.22 μm濾膜，供蘆丁、槲皮素和綠原酸待測(cè)使用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取4種對(duì)照品，各0.1 g，定容至100 mL，配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃冷藏避光保存，使用前將環(huán)磷酸腺苷儲(chǔ)備液用水稀釋成1～20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，蘆丁、槲皮素、綠原酸三種儲(chǔ)備液用30%甲醇水溶液稀釋成0.1～5 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2.3 色譜條件

環(huán)磷酸腺苷測(cè)定條件：大連依力特公司ODS-BP色譜柱（5 μm，4.6 mm×200 mm），柱溫為40 ℃，流動(dòng)相為20 mmol/L磷酸二氫鉀溶液（pH 3）-甲醇（80∶20，V/V），流速為1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，波長(zhǎng)為254 nm。

蘆丁、槲皮素、綠原酸測(cè)定條件：流動(dòng)相為20 mmol/L磷酸二氫鉀溶液（pH 3）-甲醇，流速1 mL/min，梯度洗脫，見(jiàn)表1，進(jìn)樣量為10 μL，波長(zhǎng)為325 nm。

圖1 槲皮素、綠原酸、蘆丁、環(huán)磷酸腺苷的分子結(jié)構(gòu)圖

表1 HPLC 梯度洗脫程序

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)液相色譜儀相配套的Empower 3色譜數(shù)據(jù)處理軟件完成相關(guān)成數(shù)據(jù)采集與處理，利用Origin Pro 8.5進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系與檢出限

測(cè)定質(zhì)量濃度為1，2，4，10和20 μg/mL的環(huán)磷酸腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，以及質(zhì)量濃度分別為0.1，0.2，0.4，0.8和1 μg/mL的蘆丁、槲皮素、綠原酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程和線性相關(guān)系數(shù)（R）。相關(guān)系數(shù)均大于0.999，表明在此濃度范圍內(nèi)4種待測(cè)組分線性關(guān)系良好。以3倍信噪比確定方法檢出限（LOD），LOD為0.2～1 mg/kg，結(jié)果見(jiàn)表2，對(duì)照品和紅棗樣品的色譜圖見(jiàn)圖2。

表2 4種物質(zhì)的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限

圖2 紅棗的HPLC色譜圖

2.2 測(cè)定結(jié)果

對(duì)50批次紅棗進(jìn)行測(cè)定，得到新疆紅棗中環(huán)磷酸腺苷及蘆丁、槲皮素、綠原酸的數(shù)據(jù)結(jié)果，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 50批次紅棗測(cè)定數(shù)據(jù) mg/kg

2.3 回收率與精密度試驗(yàn)

稱取已知環(huán)磷酸腺苷和蘆丁、槲皮素、綠原酸含量的同一紅棗樣品，共18份，參照4種待測(cè)組分的方法定量限、樣品平均含量以及最高含量分別添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備低、中、高3個(gè)濃度水平的加標(biāo)樣品，按照1.2小節(jié)制備，并按照規(guī)定的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品添加濃度及回收率試驗(yàn)

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一樣品處理液，室溫避光保存24 h，隔2 h測(cè)定1次，環(huán)磷酸腺苷、蘆丁、槲皮素、綠原酸峰面積的RSD分別為0.32%，0.63%，0.85%和0.68%，表明樣品處理液在室溫避光保存條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。冷藏避光保存1周，每天測(cè)定1次，環(huán)磷酸腺苷、蘆丁、槲皮素、綠原酸峰面積的RSD分別為0.58%，0.77%，0.85%和0.56%，表明樣品處理液在冷藏避光保存條件下1周內(nèi)穩(wěn)定。蘆丁、綠原酸見(jiàn)光不穩(wěn)定，光照下色澤變暗，需避光保存。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一紅棗樣品，共6份，按照上述兩個(gè)條件進(jìn)行提取并測(cè)定，計(jì)算得到環(huán)磷酸腺苷的方法RSD，為1.87%，蘆丁、槲皮素、綠原酸的方法RSD為2.31%～2.92%，表明此次試驗(yàn)中兩種提取方法重復(fù)性良好。

2.6 前處理?xiàng)l件的選擇

環(huán)磷酸腺苷的樣品提取方法主要有加熱回流提取法[7]、超聲提取法[8]、快速溶劑萃取法[9]等。經(jīng)比較，采用超聲提取法，具有經(jīng)濟(jì)、快捷的優(yōu)勢(shì)。

蘆丁、槲皮素、綠原酸樣品處理過(guò)程中[10-11]，比較100%甲醇、70%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、10%甲醇和水的處理效果。結(jié)果表明，30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇均可達(dá)到良好提取效果，當(dāng)甲醇含量較高時(shí)，雜質(zhì)溶出增加，提取液較混濁，色譜干擾嚴(yán)重。最終確定30%甲醇水溶液為提取溶劑。采用此方案還可使甲醇與水的比例和梯度洗脫初始條件下流動(dòng)相匹配，可避免樣品提取液的洗脫強(qiáng)度高于流動(dòng)相，產(chǎn)生溶劑效應(yīng)，造成色譜峰變形，分離度降低。分別考察了10，15，30，45和60 min的超聲提取效果，結(jié)果表明，超聲30 min以后，延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取率無(wú)明顯增加，故提取時(shí)間選擇30 min。

2.7 色譜條件

在測(cè)定波長(zhǎng)的選擇上，蘆丁最大吸收波長(zhǎng)為256 nm，槲皮素最大吸收波長(zhǎng)為255 nm，綠原酸最大吸收波長(zhǎng)為325 nm，因綠原酸響應(yīng)值較低，故蘆丁、槲皮素、綠原酸同時(shí)檢測(cè)時(shí)，確定其測(cè)定波長(zhǎng)325 nm。此波長(zhǎng)下，樣液中有吸收響應(yīng)的雜質(zhì)較少，因此色譜干擾峰較少，有利于待測(cè)物的準(zhǔn)確定性定量。由于環(huán)磷酸腺苷和多酚類的蘆丁、槲皮素、綠原酸均呈弱酸性，其pKa在5～6之間，因此調(diào)整磷酸二氫鉀溶液pH 3，將流動(dòng)相pH與待測(cè)組分pKa相差兩個(gè)單位，抑制待測(cè)組分電離，使其色譜行為可控，保留時(shí)間穩(wěn)定，保證了色譜分離的重現(xiàn)性。

2.8 新疆紅棗中有效成分含量分析

從50批次不同產(chǎn)品和品種的紅棗測(cè)定結(jié)果可以看出，新疆各地紅棗中綠原酸的含量為0.44～2.16 mg/kg，平均值為0.88 mg/kg；蘆丁的含量為0～14.86 mg/kg，平均值為4.43 mg/kg；槲皮素的含量為0.38～2.15 mg/kg，平均值為0.96 mg/kg；環(huán)磷酸腺苷的含量為50.48～357.28 mg/kg，平均值為190.68 mg/kg。

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)建立了高效液相色譜法測(cè)定紅棗中環(huán)磷酸腺苷及蘆丁、槲皮素、綠原酸的方法，通過(guò)提取條件的優(yōu)化，選擇了經(jīng)濟(jì)、快捷的前處理方法，建立色譜條件。總體上該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確度高、精密度好，完全滿足紅棗中4種成分測(cè)定的需求，并對(duì)新疆各產(chǎn)地不同品種50批次紅棗進(jìn)行測(cè)定。從結(jié)果看，這4種有效物質(zhì)含量差異較大，說(shuō)明產(chǎn)地、品種不同，新疆紅棗的品質(zhì)有較大差異。新疆日照時(shí)間長(zhǎng)，光熱豐富，降雨少，土質(zhì)優(yōu)，以其得天獨(dú)厚的地理氣候環(huán)境孕育了世界聞名的新疆大棗，如何全面評(píng)價(jià)新疆紅棗的品質(zhì)，使新疆的紅棗產(chǎn)業(yè)健康、持續(xù)、穩(wěn)定的發(fā)展，為紅棗的開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，是目前需要認(rèn)真研究的問(wèn)題。