HPLC同時測定涵睿膠囊8種有效成分及薄層鑒別

張海弢，付娟，楊曉筱，李曼曼，范業文

江蘇康緣藥業股份有限公司（連云港 222001）

涵睿膠囊是由紅景天、姜黃、葡萄籽提取物等制成的一款具有增強免疫力功能的保健食品，適用于免疫力低下的人群。紅景天苷是紅景天的主要活性成分，研究發現紅景天苷在增強免疫力方面具有明顯的保健功能[1-3]。山柰酚、槲皮素作為黃酮類化合物主要活性成分，研究表明其對機體免疫功能具有增強作用。姜黃素類化合物是雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的統稱，作為中藥材姜黃中的有效成分，大量研究結果顯示，其對適應免疫、固有免疫均有增強作用[4-8]。

測定復方產品中多種有效活性成分比單一指標成分測定，具有快速、準確、可靠的特點，且更加科學、全面地表征產品質量[9-13]。試驗采用小粒徑色譜柱，基于多波長快速同時測定涵睿膠囊中紅景天苷、酪醇、香豆素、槲皮素、山柰酚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素8種有效成分，該檢測方法快速、準確、可靠；采用薄層色譜法對姜黃提取物和葡萄籽提取物進行定性鑒別，方法可行，專屬性強。試驗旨在建立涵睿膠囊定性定量評價方法，以期快速、全面、有效地評價其內在質量，為從多指標、多成分角度提升涵睿膠囊質量控制水平提供研究參考，為全面控制其質量提供依據。

1 儀器和材料

Agilent 1260 HPLC色譜儀，DAD紫外檢測器（美國安捷倫科技公司）；ZF-20D三用紫外分析儀（上海越眾儀器設備有限公司）；Mettler XP6、Mettler AE240型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；Centrifuge 5415D高速離心機（德國艾本德公司）；Milli-Q超純水機（美國密理博公司）；KQ-250DB型超聲波清洗儀（昆山超聲儀器有限公司）。色譜級乙腈（美國天地公司）；硅膠G薄層層析板（青島海洋化工廠分廠、青島勝海精細硅膠化工有限公司、安徽良臣硅源材料有限公司、煙臺市化學工業研究所）。

紅景天苷（批號110818-201708，質量分數以98.8%計），姜黃素（批號110823-201405，質量分數以98.9%計），山柰酚（批號110861-201310，質量分數以93.2%計），酪醇（批號111676-200602），雙去甲氧基姜黃素（批號112004-201501，質量分數以95.0%計），槲皮素（批號100081-201509，質量分數以98.6%計），去甲氧基姜黃素（批號112003-201501，質量分數以98.5%計），姜黃對照藥材（批號121188-201304）均購自中國食品藥品檢定研究院；香豆素（批號MUST-18040901），原花青素（MUST-14081604）均購自成都曼斯特生物科技有限公司；涵睿膠囊（批號20171101、20171102、20171103、20171201、20171202，江蘇康緣藥業股份有限公司）；超純水；甲醇等試劑，除特殊說明，所用試劑均為分析純。

2 HPLC含量測定

2.1 色譜條件

以Kromasil C18柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）為色譜柱；流動相為乙腈-0.5%甲酸水溶液，梯度洗脫（0～10 min，10%～30%乙腈，10～15 min，30%～45%乙腈，15～30 min，45%～65%乙腈）；流速1.0 mL/min；檢測波長275 nm（紅景天苷、香豆素、酪醇），370 nm（槲皮素、山柰酚）和430 nm（姜黃素、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素）；柱溫30℃；進樣量10 μL，理論板數按紅景天苷峰計算，不低于6 000。見圖1。

圖1 HPLC圖譜

2.2 混合對照品溶液的制備

精密稱定適量紅景天苷、姜黃素、山柰酚、酪醇、去甲氧基姜黃素、香豆素、槲皮素、雙去甲氧基姜黃素對照品，加50%甲醇制成含紅景天苷104.95 mg/L、姜黃素137.8 mg/L、山柰酚103.37 mg/L、酪醇70.87 mg/L、去甲氧基姜黃素78.54 mg/L、香豆素76.09 mg/L、槲皮素90.05 mg/L、雙去甲氧基姜黃素147.54 mg/L混合對照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取10粒涵睿膠囊，去殼，內容物研細，混勻，取1.000 0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 50%甲醇，稱定其質量，超聲提取30 min，冷卻后再稱定其質量，補足失重，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得供試品溶液。

2.4 線性關系考察

取2.2小節的混合對照品溶液，進行等比例稀釋，注入HPLC色譜儀，測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），以對照品的峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得線性回歸方程。結果見表1。

表1 8種成分的線性關系

2.5 定量限考察

將紅景天苷等8種有效成分對照品溶液逐步稀釋后進樣，以信噪比（S/N）為10時考察其定量限，結果顯示紅景天苷、酪醇、香豆素、槲皮素、山柰酚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素的定量限分別為0.033，0.063，0.068，0.068，0.065，0.045，0.031和0.043 mg/kg。

2.6 精密度試驗

取涵睿膠囊（批號20171101）去殼，內容物研細，混勻，按照2.3小節的方法制備供試品溶液，2.1小節的色譜條件連續進樣6針，以峰面積計算8種有效成分RSD值。結果顯示紅景天苷、酪醇、香豆素、槲皮素、山柰酚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素的RSD值分別為0.56%，0.41%，0.47%，0.21%，0.35%，0.19%，0.27%和0.56%，結果表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性試驗

取涵睿膠囊（批號20171101）去殼，內容物研細，混勻，取1.0 g，精密稱定，按照2.3小節的方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，按照2.1小節的色譜條件分別于0，2，6，10，14，18和24 h注入液相色譜儀，以峰面積為指標計算8種有效成分的RSD值。結果顯示紅景天苷、酪醇、香豆素、槲皮素、山柰酚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素的RSD值分別為0.33%，0.24%，0.18%，0.26%，0.15%，0.40%，0.22%和0.39%。結果表明供試品溶液在24 h內具有良好的穩定性。

2.8 重復性試驗

取涵睿膠囊（批號20171101）去殼，內容物研細，混勻，取1.0 g，精密稱定，按2.3小節的方法平行制備6份供試品溶液，計算8種有效成分的含量。結果顯示紅景天苷、酪醇、香豆素、槲皮素、山柰酚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素含量分別為0.026，0.018，0.019，0.022，0.026，0.036，0.019和0.034 mg/kg；RSD值分別為0.41%，0.52%，0.26%，0.44%，0.35%，0.28%，0.49%和0.24%，結果表明方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗

取涵睿膠囊（批號20171101）去殼，內容物研細，混勻，取0.5 g，取9份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，3份1組，分別精密加入0.5，1.0和1.5 mL混合對照品溶液（紅景天苷、酪醇、香豆素、槲皮素、山柰酚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素質量濃度分別為1.282，0.853，0.987，1.135，1.198，1.758，0.961，1.673 mg/mL），精密加入25 mL 50%甲醇，超聲提取30 min，冷卻后搖勻，高速離心，取上清液，即得。測定，計算回收率。結果顯示紅景天苷、酪醇、香豆素、槲皮素、山柰酚、雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素的平均回收率分別為99.0%，98.7%，98.5%，99.3%，99.7%，99.8%，99.7%和100.2%；RSD分別為0.67%，0.66%，0.86%，0.56%，0.74%，0.65%，0.75%和0.96%。2.10 樣品測定

3 TLC鑒別

3.1 姜黃提取物

取3批涵睿膠囊，各20粒，除去膠囊殼，內容物研細，取0.2 g粉末，加20 mL無水乙醇，振搖，放置30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加2 mL無水乙醇使溶解，即得供試品溶液。取0.2 g姜黃對照藥材，同法制成對照藥材溶液。另取姜黃素對照品，加無水乙醇制成每1 mL含0.5 mg溶液，即得對照品溶液。分別吸取供試品溶液、對照品溶液和對照藥材溶液，各1 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，條帶狀點樣，條帶寬度4 mm，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（96∶4∶0.7）為展開劑，展開，取出，晾干，分別置日光和紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，結果見圖2。

表2 8種有效成分含量測定結果（n=2）

圖2 涵睿膠囊中姜黃提取物TLC圖譜

3.2 葡萄籽提取物

取3批涵睿膠囊，各20粒，除去膠囊殼，取0.5 g粉末于三角瓶中，加30 mL甲醇，超聲處理30 min，過濾，濾液置通風櫥中自然揮干，殘渣加5 mL甲醇使溶解，即得供試品溶液。取5 mg原花青素對照品于2 mL量瓶中，加甲醇制成每毫升含2.5 mg原花青素溶液，即得對照品溶液。分別吸取6 μL供試品溶液、對照品溶液，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮-乙酸（3∶3∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%香草醛鹽酸溶液，置于日光下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的斑點，結果見圖3。

圖3 涵睿膠囊中葡萄籽提取物TLC圖譜

4 結論與討論

涵睿膠囊經50%甲醇提取后，在190～600 nm波長范圍內通過DAD檢測器進行全波長掃描，結果顯示紅景天苷、香豆素和酪醇在波長275 nm有較強紫外吸收，山柰酚和槲皮素在波長370 nm有較強紫外吸收，姜黃素、雙去甲氧基姜黃素和去甲氧基姜黃素在波長430 nm有較強紫外吸收。通過考察不同的提取方法、提取時間和提取溶劑用量，確定涵睿膠囊有效成分測定試驗供試品溶液制備方法。考察4種不同流動相（甲醇-水、甲醇-0.5%甲酸、乙腈-水、乙腈-0.5%甲酸）對8種待測有效成分的影響，流動相乙腈-0.5%甲酸系統所得圖譜中各色譜峰的分離情況和峰形較好，故選擇乙腈-0.5%甲酸作為流動相；比較了使用Waters symmetry C18、Phenomenex Luna C18和Kromasil C18的3種不同品牌種色譜柱，結果顯示3種色譜柱無明顯差異。比較柱溫25，30和35 ℃，流速0.8，1.0和1.2 mL/min，結果無明顯差異。方法學驗證試驗結果表明紅景天苷13.15～420.89 mg/L、酪醇12.54～401.12 mg/L、香豆素13.61～435.36 mg/L、槲皮素13.62～435.88 mg/L、山柰酚12.94～414.20 mg/L、雙去甲氧基姜黃素17.93～573.64 mg/L、去甲氧基姜黃素12.32～394.32 mg/L、姜黃素17.02～544.52 mg/L，呈良好線性關系，8個成分的平均回收率分別為99.0%，98.7%，98.5%，99.3%，99.7%，99.8%，99.7%和100.2%；8種有效成分測定試驗所采用的檢測方法耐用性良好。

涵睿膠囊中姜黃提取物薄層鑒別試驗，參考《中華人民共和國藥典（一部）》2015年版姜黃藥材鑒別項下TLC方法[14]制備供試品溶液、對照藥材溶液和對照品溶液?？疾?種不同展開劑三氯甲烷-甲醇-甲酸（96∶4∶0.7）、二氯甲烷-丙酮-甲酸（96∶4∶0.7）和二氯甲烷-乙醇-甲酸（96∶4∶0.7），結果顯示展開劑為三氯甲烷-甲醇-甲酸（96∶4∶0.7）時，供試品在和對照品和對照藥材溶液相同位置顯相同顏色的斑點，斑點清晰，顏色鮮艷，分離度較好，且陰性無干擾，故選擇三氯甲烷-甲醇-甲酸（96∶4∶0.7）為展開劑；考察1，2，3和4 μL點樣量，結果顯示點樣量1 μL時，斑點已清晰，且分離度較好，無明顯差別，故確定點樣量為1 μL。對研究方法的薄層板、溫度、濕度進行考察，以確保方法的可靠性。結果顯示不同濕度（40%±5%，60%±5%和80%±5%），溫度在4 ℃和室溫，不同廠家薄層板（青島勝海精細硅膠化工有限公司、安徽良臣硅源材料有限公司、青島海洋化工廠分廠）條件下，均能得到良好的檢視，說明方法專屬性強，適合涵睿膠囊成品薄層色譜鑒別。

涵睿膠囊中葡萄籽提取物薄層鑒別試驗，采用自主建立的方法，并作了方法學驗證?？疾?種不同展開劑甲苯-丙酮-乙酸（3∶3∶1）、二氯甲烷-甲醇-甲酸（3∶2∶1）、乙酸乙酯-甲醇（2∶1），結果顯示展開劑為二氯甲烷-甲醇-甲酸（3∶2∶1）和乙酸乙酯-甲醇（2∶1）時，展開效果較差，無明顯斑點，呈現一條色帶，分離度不合格；展開劑為甲苯-丙酮-乙酸（3∶3∶1）時，供試品在和對照品溶液相同位置顯相同顏色的斑點，斑點清晰，顏色鮮艷，分離度較好，且陰性無干擾，故選擇甲苯-丙酮-乙酸（3∶3∶1）為展開劑；考察2，4，6，8和10 μL點樣量，結果顯示點樣量為6 μL時，斑點清晰，故確定點樣量為6 μL。對研究方法的薄層板、溫度、濕度進行考察，以確保方法的可靠性，結果顯示不同濕度（40%±5%，60%±5%和80%±5%），溫度在4 ℃和室溫，不同廠家薄層板（青島海洋化工廠分廠、青島勝海精細硅膠化工有限公司、煙臺市化學工業研究所、青島裕民源硅膠試劑廠）條件下，均能得到良好的檢視，說明方法專屬性強，適合涵睿膠囊成品薄層色譜鑒別。

綜上所述，試驗建立的質量評價方法穩定可靠、重現性好、專屬性強，為從多指標、多成分角度提升涵睿膠囊質量控制水平提供參考。