超高效液相色譜-串聯質譜法測定牛奶中23種獸藥

王卉，劉慶菊，韓平

1.北京農業質量標準與檢測技術研究中心（北京 100097）；2.農業部農產品質量安全風險評估實驗室（北京）（北京 100097）；3.農產品產地環境監測北京市重點實驗室（北京 100097）

飼養奶牛過程中需使用獸藥來保障奶牛的健康。然而，獸藥使用的不合理，如用藥量過大、不按療程用藥、隨意配藥、給藥途徑錯誤、未嚴格執行休藥期規定、違規使用人用藥或原料藥等，都可能使牛奶中出現獸藥殘留[1-2]，獸藥殘留會影響人體健康，產生致毒、致癌、致畸等不良影響，并且會增加人體對微生物的耐藥性[3-4]。因此，有必要監控牛奶中獸藥的殘留情況，以保障牛奶質量。

根據農業農村部第235號和2292號公告對禁限用獸藥的規定[5-6]，在牛奶中，氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、環丙沙星、恩諾沙星、二氟沙星、沙氟沙星、達氟沙星、羥氨芐青霉素、氨芐青霉素、青霉素G、鄰氯青霉素、頭孢噻呋、西馬特羅、沙丁胺醇、甲硝唑、呋喃它酮、呋喃唑酮、群勃龍、甲基睪丸酮、丙酸睪酮、己烯雌酚、氯丙嗪等23種獸藥需要重點監測，它們分別屬于喹諾酮類、β-內酰胺類、β-受體激動劑、硝基咪唑類、硝基呋喃類、性激素類、吩噻嗪類等。為保障牛奶的食用安全，需要嚴格測定牛奶中以上獸藥含量。

牛奶中獸藥的檢測方法主要有微生物檢測法、免疫分析法、適配體傳感器檢測法和液質聯用法等[7-10]，其中，微生物檢測法在檢測的靈敏度上有待進一步提高，免疫分析法和適配體傳感器檢測法等方法在檢測穩定性方面有待進一步改善，而液質聯用檢測法具有耗時短、測量范圍廣、穩定性好等優勢[11-16]，特別在多種獸藥的同時檢測中優勢明顯。因此，試驗選擇乙腈（含2%甲酸）作為提取溶劑結合固相萃取小柱，對牛奶中的23種獸藥殘留進行提取，建立UPLCMS/MS檢測牛奶中23種獸藥殘留的方法。方法操作簡便、快速、準確，可以滿足牛奶中23種獸藥分析檢測的需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶（市售）；標準品：氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、環丙沙星、恩諾沙星、二氟沙星、沙氟沙星、達氟沙星、羥氨芐青霉素、氨芐青霉素、青霉素G、鄰氯青霉素、頭孢噻呋、西馬特羅、甲硝唑、呋喃它酮、群勃龍、甲基睪丸酮、丙酸睪酮、氯丙嗪、沙丁胺醇、呋喃唑酮、己烯雌酚（純度均在98%以上，德國Dr. E公司）；甲酸、甲醇、乙腈、乙酸銨（均為質譜純，美國Fisher公司）；超純水；固相萃取小柱Oasis PRiME HLB（200 mg，6 cc，美國Waters公司）。

1.2 儀器與設備

ACQUITY超高效液相色譜儀串聯三重四級桿Xevo TQS質譜儀（美國Waters公司）；ME104E電子天平（最大稱量120 g，精度0.000 1 g，瑞士梅特勒公司）；Vortex Genie 2渦旋振蕩器（美國Scientific Industries公司）；N-EVAP氮吹儀（美國Organomation公司）；PHS-3C精密pH計（上海雷磁儀器廠）；Milli-Q超純水機（美國Millipore公司）；3-30k離心機（德國Sigma公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 牛奶中獸藥的提取

稱取1 g牛奶，加入4 mL乙腈（含2%甲酸），充分混合，在7 000 r/min下離心5 min，取3 mL上清液進行SPE凈化。

1.3.2 凈化

先用3 mL乙腈（含2%甲酸）通過Oasis PRiME HLB固相萃取柱進行活化。取3 mL牛奶樣品上清液，使其通過小柱，取2 mL上樣后的流出液于10 mL離心管中，在溫和氮氣流下揮干溶劑，用1 mL 5%甲醇水溶液復溶，過0.22 μm微孔濾膜，再將其轉移至樣品瓶中，待UPLC-MS/MS分析。

1.3.3 獸藥標準溶液的配制

分別準確稱取10 mg獸藥標準品，用甲醇定容至10 mL，配制成1 mg/mL標準儲備液，在-20 ℃保存，獸藥混合標準工作溶液現用現配。

1.3.4 液相色譜條件

色譜柱ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），進樣體積5 μL；柱溫45 ℃；流動相A為水（含0.1%甲酸），流動相B為甲醇（含0.1%甲酸），流速0.45 mL/min，采用梯度洗脫程序：0～0.15 min，2% B；0.15～1.95 min，2%～26% B；1.95～2.95 min，26%～35% B；2.95～7.50 min，35%～99% B；7.50～8.00 min，99% B；8.00～8.01 min，99%～2% B；8.01～10.00 min，2% B。

1.3.5 質譜條件

采用ESI源，電噴霧模式采用ESI+和ESI-這2種模式；毛細管電壓3.5 kV；離子源溫度150 ℃；錐孔氣流速150 L/h；脫溶劑氣溫度600 ℃；脫溶劑氣流速1 000 L/h；碰撞氣流速（氬氣）0.15 mL/min。

1.4 數據處理

Masslynx 4.1數據采集分析軟件。

2 結果與分析

2.1 前處理條件的優化

在牛奶的獸藥殘留提取試驗中，常用乙腈作為提取溶劑[17-18]。乙腈不僅可以提取獸藥化合物，還能沉淀牛奶中的蛋白質。分別用乙腈（含2%甲酸）和80%乙腈（含0.2%甲酸）溶液對牛奶樣品中的獸藥殘留進行提取，結果顯示，乙腈（含2%甲酸）的提取效果更好，平均回收率為95.67%，而80%乙腈（含0.2%甲酸）溶液的平均提取回收率為85.62%，因此試驗選擇乙腈（含2%甲酸）作為提取溶劑。由于測定的23種獸藥化學性質差異較大，不適宜采用吸附-淋洗-洗脫的方式凈化，所以選擇用固相萃取小柱吸附雜質，作為目標化合物通過的方式凈化。有研究發現Oasis PRiME HLB小柱對牛奶提取液中的蛋白、脂肪和磷脂等雜質的吸附效果較好[19-21]。因此，選用Oasis PRiME HLB對牛奶樣品進行凈化處理，并對上樣體積進行優化。結果表明，上樣體積分別為3和4 mL時，平均回收率分別為95.67%和94.89%，無明顯的區別，由于體積大時，收集流出液所需時間長，因此選擇上樣體積3 mL進行凈化。

2.2 色譜條件優化

選取ACQUITY UPLC BHE C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱和ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱，通過比較2種色譜柱對23種獸藥化合物的保留情況，并綜合考慮化合物的保留時間、離子化效率和分段掃描等因素，發現ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱對目標化合物的分離效果更好，因此選擇該色譜柱進行試驗。流動相極性和pH對化合物的保留和分離影響較大，試驗比較甲醇-水、乙腈-水、甲醇（含0.1%甲酸）-水（含0.1%甲酸）、甲醇（含0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸銨）-水（含0.1%甲酸）等不同流動相條件，試驗發現以甲醇（含0.1%甲酸）和水（含0.1%甲酸）為流動相時，化合物的分離效果最好，靈敏度最高，酸度低時，喹諾酮類化合物會出現拖尾現象。因此，試驗采用此流動相優化梯度洗脫程序。

2.3 質譜條件的優化

將23種獸藥分別配制成200 μg/L單標溶液，液相流速設為10 μL/min，使用Masslynx 4.1軟件的調諧功能，找到23種化合物的母離子和子離子，通過優化碰撞能、去簇電壓、錐孔電壓等，確定各離子的最佳質譜參數，如表1所示。其中，己烯雌酚是在ESI-離子化模式下進行檢測的，其他化合物均在ESI+離子化模式下檢測，對23種獸藥標樣進行測定時，其出峰時間見表1，MRM色譜圖如圖1所示。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍、線性方程、檢測限和定量限

在最佳儀器條件下，配制不同濃度的混合標準工作溶液，以定量離子對的峰面積為縱坐標（y），以標準品的濃度為橫坐標（x）繪制標準工作曲線，計算得到化合物的線性方程、相關系數、線性范圍，以化合物信噪比S/N=3時對應的濃度作為最低檢測限（LODs），以標準曲線上的最低點作為定量限（LOQs），結果列于表2。

2.4.2 準確度和精密度

取不含上述23種待測獸藥的牛奶作為基質，進行低、中、高3個濃度水平的添加回收試驗，重復測定6次，加標回收試驗結果見表3，加標回收率為70.98%～118.63%，相對標準偏差為0.14%～11.55%。

表1 目標化合物的質譜分析參數

圖1 23種獸藥化合物混合對照品的MRM色譜圖

表2 23種藥物線性回歸方程、相關系數、檢出限和定量限

表3 23種獸藥化合物的回收率和精密度結果（n=6）

3 結論

建立超高效液相色譜-串聯質譜測定牛奶中23種禁限用獸藥的方法，采用乙腈（含2%甲酸）作為提取溶劑，用Oasis PRiME HLB小柱進行凈化處理，方法靈敏度高，操作方便。方法的線性、檢測限和定量限均符合殘留檢測的要求。