響應面法優化中藥烏賊墨酶解工藝及體外抗腫瘤活性研究

陶然 劉富菁 王婭玲

摘 ? ? ?要：以水溶性總蛋白及總多糖雙指標優化中藥烏賊墨酶解法提取工藝并進行了體外抗腫瘤活性研究。以中藥烏賊墨總蛋白、總多糖為指標，采用單因素實驗，分別考察酶解時間、加酶量和酶解pH值對雙指標的影響，在此基礎上，應用響應面試驗設計法優化中藥烏賊墨酶解提取工藝，最后在最佳酶解提取工藝的條件下，采用MTT法對酶解物凍干粉進行體外抗肝癌Bel-7402細胞株的實驗研究。結果最佳工藝條件為：酶解時間4.50 h，加酶量為2 500 u，pH為10.6;在此條件下，烏賊墨水溶性總蛋白的得率最高為38.34%，水溶性總多糖的得率最高為12.26%。最佳條件下制得的烏賊墨酶解液對肝癌Bel-7402細胞株有一定的抑制作用，抑制率達到70%～80%。通過響應面法優化烏賊墨酶解工藝條件，使水溶性總蛋白及總多糖得率增加，為烏賊墨活性成分及抗腫瘤研究奠定基礎。

關 ?鍵 ?詞：烏賊墨;酶解;響應面法;水溶性總蛋白;水溶性總多糖;肝癌Bel-7402細胞株

中圖分類號：R282.77 ? ? ? 文獻標識碼： A ? ? ? 文章編號： 1671-0460（2020）05-0855-05

Abstract： The extraction process of squid ink was optimized， and the antitumor activity in vitro was studied. Taking the total protein and total polysaccharide of squid ink as indexes， the effect of hydrolysis time， amount of enzyme and PH value of hydrolysis on the two indexes was investigated by single factor experiment. On this basis， the extraction process of squid ink was optimized by response surface design. Finally， under the optimum conditions of enzyme hydrolysis and extraction， MTT method was used to study the effect of lyophilized powder of enzyme hydrolysate on liver cancer Bel-7402 cell line in vitro. The optimum conditions were determined as follows： the hydrolysis time 4.50 h， the amount of enzyme 2 500 u， and the pH 10.6. Under these conditions， the highest yield of water-soluble total protein was 38.34%， and the highest yield of water-soluble total polysaccharide was 12.26%. Under the optimum conditions， the squid ink hydrolysate could inhibit the liver cancer Bel-7402 cell line to a certain extent， and the inhibition rate was 70%～80%. After the enzymatic hydrolysis conditions of squid ink were optimized by response surface method， the yield of water-soluble total protein and total polysaccharide was increased， which laid a foundation for the study of active components and antitumor activities of squid ink.

Key words：Squid ink; Enzymolysis; Response surface method; Water soluble total protein; Water soluble total polysaccharide; Liver cancer cell line Bel-7402

烏賊墨存在于烏賊的墨囊中，由黑色素和蛋白多糖復合體組成，其蛋白質和糖類的含量分別為6.3%、3.0%。現代研究表明，烏賊墨中的多糖、蛋白質、多肽等活性物質均具有良好的抗腫瘤、抗氧化等作用。酶解技術在中藥有效成分提取中具有明顯優勢，其可在溫和的條件下提高中藥有效成分的浸出率，保證藥物有效成分的藥效[1]。同時酶可使蛋白質、糖蛋白等成分水解成小分子活性肽或多糖類物質，從而有效地發揮其藥理作用。酶的催化能力受pH值、酶解溫度等因素的影響較大，因此對于特定藥物，研究酶反應的最佳條件尤為重要[2]。在前期實驗研究中，我們仿照人體胃腸道的環境和運行原理，已經明確了烏賊墨最佳的酶解溫度為37 ℃、最佳的用酶為胰蛋白酶[3]。本次實驗首先采用單因素方法，分別考察酶解時間、加酶量和酶解pH值對烏賊墨中總蛋白、總多糖提取率的影響，在此基礎上，應用響應面試驗設計法優化中藥烏賊墨酶解提取工藝，最后在最佳酶解提取工藝的條件下，采用MTT法對酶解物凍干粉進行體外抗肝癌Bel-7402細胞株的實驗研究。

1 ?試劑與儀器

胰酶細胞消化液、RPMI Medium 1640培養基、牛血清蛋白、胰蛋白酶（上海源葉生物科技有限公司）;葡萄糖、福林酚、濃硫酸（國藥集團化學試劑有限公司）;FA1204B型分析天平（上海天美天平儀器有限公司）;KQ-500GVDV雙頻恒溫數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;DNM-9602酶標分析儀（北京普朗新技術有限公司）;烏賊墨（SepiellamaindronideRochebrune）凍干粉經山東中醫藥大學高德民副教授鑒定為正品。

2 ?方法及結果

2.1 ?烏賊墨酶解液的制備工藝流程

烏賊墨→凍干制粉→精密稱取1.000 g→加40倍蒸餾水溶解→超聲提取（80 Hz）30 min→調節pH→加胰蛋白酶→37 ℃酶解→3 000 r·min-1、4 ℃離心10 min→抽濾、定容至100 mL→稀釋至適宜濃度→水溶性總蛋白質、水溶性總多糖含量測定。

2.2 ?水溶性總蛋白及水溶性總多糖含量測定

采用改良lowry法[4]，Y = 2.267 5X+ 0.003 9， R2 = 0.998 4，測定蛋白質含量。采用苯酚-硫酸法[5]，Y= 13.484X+ 0.007 2，R2 = 0.998 8，測定多糖含量。（Y吸光度值;X：標準溶液濃度）。

2.3 ?單因素試驗考察烏賊墨酶解工藝

多糖與蛋白質均為烏賊墨酶解液中的主要有效成分。以水溶性總蛋白質、水溶性總多糖為雙指標，分別探討酶解過程中酶解時間、加酶量、pH對各指標的影響。設定各指標的權重系數均為1，提取工藝優化過程中，先算出水溶性總多糖及總蛋白得率，再按公式進行標準化處理，得綜合評價值[6]。

2.3.1 ?酶解時間對水溶性總多糖及總蛋白得率影響

酶解時間分別選取2、3、4、5、6、7、8 h，固定pH調至8.0，酶活力為2 000 u。由圖1可知，隨著酶解時間的延長，可提高蛋白質和多糖溶出，在2～8 h內，酶解液中總多糖及總蛋白質得率均先升高后降低。在2～4 h內，蛋白質得率不斷提升，因為隨時間延長，酶與藥液充分酶解，4～8 h內呈現先緩慢升高后平緩下降的趨勢，并且在6 h達到最大值。多糖得率的變化不如蛋白質明顯，總體呈現緩慢上升后得率逐漸穩定的趨勢，并于4 h達到最大值。根據水溶性總蛋白質及多糖的得率，結合綜合評價值，選擇3、4、5 h進行工藝優化。

2.3.2 ? pH對水溶性總多糖及總蛋白得率的影響

pH分別調至6、7、8、9、10、11、12，固定酶解時間為4 h，酶活力為2 000 u。由圖2可知，pH的變化對蛋白質、多糖得率影響均較大。隨著pH的不斷提升，總蛋白得率先升高趨于平衡后下降，并于pH值為10時得率最高。在pH為6～10之間總蛋白質得率增長迅速，pH為10～12范圍內呈現先趨于平衡后下降趨勢，可見堿性條件有利于蛋白質的溶出。在pH為6～12之間總多糖的得率呈現先升高后下降的趨勢，在pH值為10時總多糖的得率達到最大。根據水溶性總蛋白質及多糖的得率，結合綜合評價值，選擇pH為9、10、11進行工藝優化。

2.3.3 ?酶活力對水溶性總多糖及總蛋白得率的影響

分別加胰蛋白酶1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 u，固定酶解時間為4 h，pH為8.0。由圖3可知，在試驗范圍內，總多糖得率隨酶活力增加呈現先升高后降低的趨勢，在酶活力為2 500 u時多糖得率達到最大。蛋白質得率在酶活力為1 000～1 500 u呈現上升趨勢，在2 000～3 000 u范圍內呈現先下降后趨于平衡。根據水溶性總蛋白質及多糖的得率，結合綜合評價值，選擇酶活力1 500、2 000、2 500 u進行工藝優化。

2.4 ?響應面法設計優化烏賊墨酶解工藝[7]

2.4.1 ?響應面法實驗結果與分析

在單因素試驗的基礎上，采用響應面中心組合試驗設計優化提取烏賊墨水溶性總多糖及水溶性總蛋白的工藝參數。以水溶性總蛋白得率（Y1）及水溶性總多糖得率（Y2）為指標，考察酶解時間（A）、pH（B）、酶活力（C）對制備工藝的影響。采用Design-Expert8.0.6軟件對數據進行統計分析（以P<0.05作為判斷顯著性的標準），見表1-2。

根據表3、4方差分析所示，本實驗所選用的二次多項模型具有顯著性（P<0.05），失擬項的P值為0.555 5、0.210 7，均表現為不顯著，表明該回歸模型理想。用方程Y1和Y2擬合3個因素（酶解時間、pH、酶活力）與水溶性總蛋白及總多糖得率之間的關系是可行的。對于水溶性總蛋白得率（Y1），其決定系數R2為0.998 0，校正決定系數R2adj為0.995 5，說明該模型能解釋99.55%響應值。對于水溶性總多糖得率（Y2），其決定系數R2為0.984 5，校正決定系數R2adj為0.964 6，說明該模型能解釋96.46%響應值。

表3的方差分析結果表明，A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2對水溶性總蛋白得率（Y1）影響顯著，即時間、pH、酶活力3因素均對水溶性總蛋白得率有顯著影響，交互作用時間與酶活力影響最顯著。表4的方差分析結果表明，A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2對水溶性總多糖得率（Y2）影響顯著，即時間、pH、酶活力三個因素均對水溶性總多糖得率（Y2）有顯著影響，交互作用時間與酶活力對水溶性總多糖得率有顯著影響。上述結果表明響應值的變化相當復雜，各個試驗因素對響應值的影響呈二次關系，且各因素之間有相互影響。

2.4.2 ?各因素對響應面值的影響

如圖4所示，在實驗范圍內，水溶性總蛋白質得率及水溶性總多糖得率均隨著酶解時間、pH、酶活力的增加呈現先增加后下降的趨勢，說明這3個因素均有最佳值。

2.4.3 ?最佳酶解工藝驗證

通過Design-Expert8.0.6軟件，得到最優工藝為酶解時間4.5 h，pH值為10.6，酶活力為2 500 u，此時水溶性總蛋白質理論得率為33.64%，水溶性總多糖理論得率為11.24%。

按照選取的最佳工藝條件重復3次試驗，得到平均水溶性總蛋白得率為38.34%，水溶性總多糖得率為12.26%，實驗結果與最佳工藝預測值接近，說明該工藝穩定可靠。

2.5 ?MTT法測定烏賊墨酶解產物對肝癌Bel-7402細胞株的抑制作用

采用MTT法進行體外抗腫瘤實驗研究[4]，通過測定細胞抑制率可以反映藥物對細胞增殖的影響。圖5為最佳工藝條件下的烏賊墨酶解液對肝癌Bel-7402細胞株的抑制率，由圖可知，在藥物濃度0.2～0.8 mg·mL-1范圍內，細胞抑制率均為超過50%，在藥物濃度0.8～0.1 mg·mL-1之間，細胞抑制率持續上升，在藥物濃度1.0 mg·mL-1時，細胞抑制率達到73.85%。在藥物濃度1.0～2.0 mg·mL-1范圍內，細胞抑制率在67%～77%之間波動。

3 ?結論

烏賊墨作為傳統中藥，主要用于止血。隨著近代研究發現其具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌等活性，具有豐富的營養價值與藥用價值，但烏賊墨作為烏賊的副產品，目前并未得到充分利用。烏賊墨的主要成分是黑色素、黑素蛋白、蛋白多糖復合體，黑色素中還含有次生降解低聚糖，但黑色素的水溶性較差，可溶于堿性溶液，在酸性環境會產生沉淀[8]。而胰蛋白酶為酸蛋白酶，最適pH值為7.8～8.5左右，堿性過強強會使酶的活性降低。因此、考察pH對酶解工藝的影響尤為重要。通過酶解可使黑素蛋白、糖蛋白等物質水解為小分子活性肽和糖類物質，從而提高活性成分的溶出，增加其藥理活性。

文中采用半仿生-酶解法，在37 ℃用胰蛋白酶酶解烏賊墨，以水溶性總蛋白質及水溶性總多糖的得率為指標，在單因素試驗基礎上，通過響應面試驗優化，得最佳酶解工藝為：酶解時間4.5 h、 pH為10.6、酶活力2 500 u。體外藥理實驗研究表明，經胰蛋白酶酶解后的烏賊墨酶解液可以在體外抑制肝癌Bel-7402細胞株的生長。

參考文獻：

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