肺腺癌預后關鍵基因的篩選、驗證及其調控通路分析

李昂，謝俞寧，仵紅嬌，李佳瑩，張雪梅

華北理工大學，河北唐山063210

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌(NSCLC)，其中NSCLC約占肺癌的85%[1,2]。目前針對肺癌的治療方法主要有手術切除、化療和靶向治療，但是NSCLC患者的5年生存率僅為17%[3]。肺腺癌是NSCLC中最常見的亞型，其發病率逐年上升且患者預后較差。因此，臨床亟需深入研究肺腺癌的發生發展機制，并尋找潛在的關鍵預后標志物。近年來,利用高通量測序技術檢測大量基因表達變化，并結合生物信息學方法系統分析腫瘤相關基因及其調控機制，已成為功能基因組學的一種重要研究手段，廣泛應用在篩選腫瘤潛在生物標志物的研究中。2020年3～4月，本研究整合了癌癥基因組圖譜(TCGA)和GEO數據庫中的肺腺癌預后相關mRNA數據，篩選出肺腺癌預后關鍵基因并進行驗證，以期為肺腺癌的分子機制研究及預后判斷提供依據。現報告如下。

1 方法

1.1 數據獲取 通過TCGA數據庫下載556例份肺腺癌組織和59例份正常肺組織樣本的轉錄組數據及500例肺腺癌患者的臨床資料。使用GEO數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索肺腺癌組織芯片數據，最終選用GSE10072、GSE43458、GSE32863三個與肺腺癌相關的mRNA芯片進行后續分析，見表1。

表1 肺腺癌相關GEO數據集的基本信息

1.2 共同差異表達基因篩選 使用R語言“edgeR”程序包對TCGA數據庫中肺腺癌表達譜數據進行標準化及差異分析，同時運用“limma”包分別對GEO數據庫中三個與肺腺癌相關的mRNA芯片進行差異表達基因篩選(|log2FC|>1，P<0.05)，并繪制差異表達基因火山圖。使用FunRich工具構建TCGA與GEO數據庫中差異表達基因的Venn圖，選擇共同差異表達基因進行后續分析。

1.3 肺腺癌預后關鍵基因篩選 對TCGA和GEO數據庫篩選出的共同差異基因進行單因素COX回歸分析，篩選與肺腺癌患者預后相關的基因。采用LASSO回歸分析，進一步縮小預后相關基因的范圍，以保證結果穩定性。最后對LASSO回歸分析篩選出的肺腺癌預后相關基因進行多因素COX回歸分析，得到肺腺癌預后相關的獨立預測因子，即預后關鍵基因。

1.4 肺腺癌預后關鍵基因的驗證

1.4.1 風險評分驗證 以1.1中TCGA數據庫中的500例肺腺癌患者為研究對象，采用風險評分公式計算每個樣本的風險評分，風險評分=(0.858 91×DCN)+(1.380 54×ECT2)+(1.429 83×RRAS)+(0.946 68×PCP4)。以風險評分的中位數作為臨界值，將患者分為高風險組和低風險組。繪制生存曲線，比較兩組5年生存率；繪制該風險評分預測肺腺癌患者5年生存率的ROC曲線，以驗證其準確性。

1.4.2 癌組織預后關鍵基因表達與肺腺癌患者預后的關系 ①預后關鍵基因表達分析：采用GEPIA在線數據庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析預后關鍵基因表達，該數據庫包括來自TCGA和GTEx數據庫的肺腺癌組織9 736例份與正常肺組織8 587例份。②肺腺癌組織中預后關鍵基因表達水平與患者預后的關系分析：使用Kaplan Meier-plotter數據庫(http://www.kmplot.com/)計算出各基因相對表達量的最佳截斷值，根據此最佳截斷值將患者分為高、低表達者，繪制生存曲線，比較其5年生存率。

1.5 預后關鍵基因的調控通路分析 在分子特征數據庫(MSigDB，http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp)，下載“c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt”基因集作為參考基因集。根據預后關鍵基因的表達中值，將肺腺癌組織分為高表達組和低表達組。利用R包“GSVA”對TCGA數據庫中肺腺癌差異基因的RNA測序數據進行基因集變異分析(GSVA)，以P<0.01為標準，分析與預后關鍵基因表達相關的通路。

2 結果

2.1 肺腺癌組織差異表達基因篩選結果 在TCGA數據庫中肺腺癌表達譜分析結果顯示，共得到差異表達基因4 815個，其中上調基因2 879個、下調基因1 936個。在GEO數據庫中對GSE10072、GSE43458、GSE32863三個有關肺腺癌的mRNA芯片表達數據分析結果顯示，共得到差異表達基因178個，其中上調基因34個、下調基因144個。兩個數據庫的共同差異表達基因共166個。

2.2 肺腺癌預后關鍵基因篩選結果 單因素COX回歸分析結果顯示，共獲得與肺腺癌患者預后相關基因75個(P均<0.05)，按照P值由小到大排序，前10個與肺腺癌患者預后相關的基因見表2。LASSO回歸分析結果顯示，共篩選出19個與肺腺癌預后相關的關鍵基因，分別為SFTPC、TNNC1、FAM189A2、KLF4、CYP4B1、DPYSL2、IL33、DCN、CRTAC1、ECT2、SCGB1A1、IGF2BP3、SLC7A5、RRAS、WASF3、ARHGEF6、FBLN5、TIMP1、PCP4。多因素COX回歸分析結果顯示，DCN、RRAS、ECT2、PCP4是肺腺癌預后相關的獨立預測因子(P均<0.05)。見表3。

表2 前10個與肺腺癌預后相關基因的單因素COX回歸分析結果

2.3 風險評分驗證結果 以風險評分的中位數0.948 374 4作為截斷值，將患者分為高風險組和低風險組，每組250例。高、低風險組5年生存率分別為29.3%、48.4%，兩組比較P<0.01。見圖1。該風險評分預測肺腺癌患者5年生存率的ROC曲線下面積(AUC)為0.628，見圖2。

表3 肺腺癌預后相關基因的多因素COX回歸分析結果

圖1 高風險組和低風險組的生存曲線

圖2 該風險評分預測肺腺癌患者5年生存率的ROC曲線

2.4 肺腺癌組織中預后關鍵基因表達與患者預后的關系 GEPIA數據庫分析結果顯示，肺腺癌組織中DCN、RRAS mRNA表達均低于正常肺組織，ECT2、PCP4 mRNA表達均高于正常肺組織(P均<0.05)。見圖3。DCN、RRAS、ECT2、PCP4高表達者的5年生存率分別為67.0%、51.0%、54.4%、57.7%，低表達者分別為52.5%、65.9%、65.1%、70.1%；RRAS(HR=1.65)、PCP4(HR=1.7)、ECT2(HR=1.38)高表達者5年生存率明顯低于低表達者，DCN(HR=0.46)高表達者5年生存率明顯高于低表達者(P均<0.01)。見圖4。

2.5 肺腺癌預后關鍵基因的調控通路分析結果 GSVA結果顯示，DCN高表達組相關調控通路富集在細胞黏附、JAK-STAT信號、補體和凝結級聯、NK細胞介導的細胞毒性、Toll樣受體等途徑；RRAS高表達組相關調控通路富集在溶酶體、硫代謝、糖胺聚糖降解等非腫瘤相關途徑；ECT2高表達組相關調控通路富集在同源重組、核苷酸切除修復、錯配修復、DNA復制和細胞周期等途徑；PCP4高表達組相關調控通路富集在趨化因子信號、細胞黏附等途徑。

注：A為DCN，B為ECT2，C為RRAS，D為PCP4。

注：A為DCN，B為ECT2，C為RRAS，D為PCP4;-----為高表達者，——為低表達者。

3 討論

本研究基于GEO和TCGA公共數據庫，在全基因組水平上分析了肺腺癌組織的遺傳學特征，以期發現在癌癥預后中顯著改變的基因及潛在標志物。本研究將LASSO引入到COX回歸模型中[4]，共篩選得到DCN、RRAS、PCP4、ECT2這4個與肺腺癌患者預后顯著相關的關鍵基因，并通過Kaplan Meier和ROC曲線進行了驗證。目前，DCN、RRAS、PCP4、ECT2在肺腺癌及其他惡性腫瘤中的報道比較少。DCN是一種富含亮氨酸的蛋白聚糖，其過表達可顯著抑制肺腺癌進展[5]。DCN 5′-UTR的甲基化與其表達降低相關，可增強具有高轉移潛能的NSCLC細胞中TGF-β/Smad信號傳導[6]。一項乳腺癌相關的Meta分析結果表明，DCN高表達與乳腺癌患者預后良好相關[7]。RRAS是RAS超家族成員之一，在多種組織中均有表達，可調節細胞黏附、遷移和分化。研究發現，RRAS在乳腺癌組織中低表達，并且RRAS可抑制乳腺癌細胞增殖、遷移和細胞周期過程[8]。此外，RRAS還可通過激活PI3K/AKT/mTOR信號傳導途徑，促進宮頸上皮細胞增殖[9,10]。目前尚未有RRAS與癌癥預后關系的相關報道。本研究生物信息結果分析發現RRAS在肺腺癌組織中低表達，且低表達患者預后良好。分析原因，可能是RRAS低表達僅參與了肺腺癌的發生，但不會促進肺腺癌進展，但仍需要進一步實驗進行驗證。既往相關研究表明，PCP4不僅可作為食管癌的預后標記基因[11]，還可抑制上皮間充質轉化和促進細胞凋亡，是乳腺癌治療的潛在靶點[12]。ECT2是Rho家族中GTP酶的鳥嘌呤核苷酸交換因子[13]，高表達的ECT2與許多腫瘤的發生、發展有關，是肺腺癌患者總體生存率低的獨立危險因素[14]，這與我們的研究結果相一致。Luo等[15]研究發現，結直腸癌組織中ECT2表達升高與TNM分期及患者總體存活率降低顯著相關。Wang等[16]研究表明，ECT2在乳腺癌的發生、發展中具有重要作用，并具有獨立的預后預測價值，或可成為乳腺癌治療的新靶點。

為了進一步探討DCN、RRAS、ECT2和PCP4在肺腺癌中的潛在機制，本研究基于TCGA表達譜數據進行了GSVA。結果顯示，RRAS高表達組相關調控通路富集在溶酶體、硫代謝、糖胺聚糖降解等非腫瘤相關途徑，或許這也是RRAS在肺腺癌中研究較少的原因；DCN高表達組相關調控通路富集在細胞黏附、JAK-STAT信號、補體和凝結級聯、NK細胞介導的細胞毒性、Toll樣受體等途徑，進一步表明DCN可通過免疫途徑抑制肺腺癌的發生發展，從而影響患者預后；ECT2高表達組相關調控通路富集在同源重組、核苷酸切除修復、錯配修復、DNA復制和細胞周期等途徑，上述途徑與肺腺癌細胞增殖過程的激活有關；PCP4高表達組相關調控通路富集在趨化因子信號、細胞黏附等途徑。以上發現為DCN、RRAS、ECT2和PCP4影響肺腺癌患者預后的相關機制提供了新的見解。