2013～2019年青島市新生兒高苯丙氨酸血癥篩查情況及基因突變分析

呂金峰，候方，王偉青，陳艷萍

1青島市婦女兒童醫院，山東青島266034；2青島大學附屬醫院

高苯丙氨酸血癥(HPA)是一種常染色體隱性遺傳性代謝病，是我國最早進行的新生兒疾病篩查病種之一。HPA根據病因可分為苯丙氨酸羥化酶(PAH)缺乏癥及其輔酶四氫生物蝶呤(BH4)缺乏癥兩類。HPA患兒因酶的缺乏，體內的苯丙氨酸(Phe)不能代謝為酪氨酸(Tyr)，Phe及其旁路代謝產物在體內蓄積而損傷神經系統，導致智力發育落后、小頭畸形、癲癇、自閉等。早篩查、早診斷、早治療可以避免HPA患兒發生神經系統損傷，保障患兒的智力和體格發育水平。隨著國家對新生兒出生缺陷的重視，該病的篩查覆蓋率越來越廣。本研究對青島市新生兒HPA篩查情況進行調查，并對HPA患兒進行基因變異分析。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2013年1月1日～2019年12月31日在青島市具有接產資格的96家醫院出生并參加HPA篩查的新生兒375 697例，均出生滿72 h且充分哺乳6次以上，其中男195 242例、女180 455例。本研究通過醫院倫理委員會審核，新生兒監護人均簽署知情同意書。

1.2 HPA篩查方法 采用串聯質譜非衍生化法。采集新生兒足后跟血滴于Whatman903濾紙片上，血斑數3～4個、直徑>8 mm，自然陰干。排除存在溶血、反復擠壓、重復滴血、污染等情況的不合格樣本。采用液相色譜-質譜聯用分析儀TQ Detector(美國Waters公司)檢測血漿Phe、Tyr，嚴格按照非衍生化法多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測定試劑盒(串聯質譜法，美國PerkinElmer公司)說明書進行操作。根據2014年的HPA診治共識[1]，串聯質譜法檢測Phe>120 μmol/L且Phe/Tyr>2.0則確診為HPA。對確診HPA的患兒行檢尿蝶呤譜分析、紅細胞DHPR活性測定、BH4負荷試驗及基因檢測，區分PAH缺乏癥和BH4缺乏癥。根據血漿Phe水平評價PAH缺乏癥：Phe為120～360 μmol/L定義為輕度HPA，360～1 200 μmol/L定義為輕度苯丙酮尿癥(PKU)，≥1 200 μmol/L定義為經典PKU。

1.3 基因突變位點檢測方法 采用高通量測序法。對于確診HPA的患兒，抽取患兒及其父母外周血2 mL，使用QIAGEN試劑盒，按照Illumina標準化流程制備基因組DNA。純化擴增后，對HPA患兒PAH及BH4合成代謝相關基因(PTS、GCH1)的184個突變位點的外顯子及其側翼序列進行高通量測序，采用Sequencing、GeneTool等軟件對測序結果進行序列比對和分析，對患兒父母采用Sanger測序進行變異基因的來源驗證。所有基因突變位點經過PAH數據庫和PubMed數據庫確定突變類型、核苷酸突變、蛋白質改變、突變頻數、突變頻率及其相關表型。

1.4 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件。計數資料以例表示，結果比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HPA篩查結果 參加HPA篩查的375 697例新生兒中，確診HPA 69例，PAH缺乏癥64例、BH4缺乏癥5例，PAH缺乏癥患兒中輕度HPA 23例、輕度PKU 22例、經典PKU 19例。2013～2019年HPA發病率比較P均>0.05，平均發病率為1.84/萬。見表1。

表1 青島地區2013～2019年新生兒HPA篩查結果

2.2 基因突變位點檢測結果 54例HPA患兒行基因突變位點檢測，其中純合突變1例、雜合突變7例、復合雜合突變46例，存在PAH基因突變50例、BH4基因(PTS基因)突變4例。50例PAH基因突變患兒突變情況及其相關表型見表2。

表2 50例PAH基因突變患兒突變情況及其相關表型

3 討論

HPA是一種常染色體隱性遺傳病，表現為體內的Phe不能代謝為Tyr。Phe的正常代謝需要PAH和BH4的共同參與，PAH基因突變可導致患者體內PAH缺乏，BH4合成代謝中相關基因(PTS、GCH1、SPR、QDPR和PCBD1)突變可導致患者體內BH4缺乏。近年來研究發現，DNAJC12基因突變也可以導致人體內PAH酶活性降低[2～4]。PAH活性降低或缺乏可導致Phe羥化受阻，Phe在體內大量蓄積，引起智力發育落后、抽搐、小頭畸形、毛發顏色淺等。同時，由于旁路代謝途徑的增強，大量的苯乳酸從尿中排出，使患兒尿液具有特殊的鼠尿味。BH4是PAH、色氨酸羥化酶和酪氨酸羥化酶的輔酶，其缺乏可導致肌張力低下、運動障礙、嗜睡、反應遲鈍、小腦發育障礙等嚴重的神經系統癥狀。HPA的發病率具有明顯的地域差異，土耳其發病率為1∶2 600[5]，歐洲為1∶8 000[6]，美國為1∶15 000[7]，韓國為1∶41 000[8]，而中國的總體發病率為1∶10 397[1]。本研究中青島市7年平均發病率為1∶5 445(1.84/萬)，高于中國總體發病率。

本研究對54例HPA患兒進行了基因檢測，其中50例存在PAH基因變異，共95個變異等位基因，檢出率達95%，與宋昉等[9]報道的北方地區平均檢出率(94.6%)接近。本研究共檢測到36個不同的變異位點，最常見的變異位點為p.R53H(18.95%)、p.R243Q(17.89%)、p.Y356X(7.37%)、p.R241C(6.32%)、p.A434D(5.26%)、p.R111X(5.26%)，與陳晨等[10]、羅靜思等[11]報道的變異位點基本相同，但未檢測到河南和福建地區常見的突變EX6-96A>G[10,12]，僅檢測到1次廣西地區[11]最常見的突變p.R408Q。本研究基因檢測結果與王慧琴等[13]報道的新疆維吾爾族HPA突變類型差異很大，因此不同地區的HPA突變數據不盡相同。

本次篩查的患兒中PAH基因存在等位基因異質性，最常見的變異類型為錯義突變(74.74%)，其次為無義突變(13.68%)。對PAH數據庫(http://biopku.org/home/pah.asp)進行檢索，截止2019年11月10日收錄的PAH基因突變數量為1 184 個，變異位點主要位于7號外顯子、6號外顯子、3號外顯子和11號外顯子。本研究中PAH基因變異頻率最高的也是7號外顯子(29.47%)，其次為2號外顯子(18.95%)和11號外顯子(12.63%)。本研究50例PAH缺乏癥患兒中，7例雜合突變患兒通過臨床表現確診，2例確診為輕度PKU，5例確診為輕度HPA。這7例患兒的基因檢測結果與該病的遺傳規律不相符，可能的原因有：①受該基因檢測技術的限制，只能檢測已知的變異位點，不能檢測新的突變位點及大片段缺失或重復。②未進行相關突變基因DNAJC12[3～5]的檢測。③存在其他影響蛋白質功能的因素等。另外，本研究4例患兒確診為BH4缺乏癥，攜帶有PTS基因，為6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶缺乏型。

綜上所述，2013～2019年青島市新生兒HPA平均發病率高于全國水平，PAH基因最常見的變異位點為p.R53H、p.R243Q，并存在等位基因異質性。基因檢測不僅能鑒別HPA的類型，還可通過基因型和表型的關系進行疾病的分型、預后判斷，并對臨床生化表型不典型者進行確診。對已經明確基因突變的患兒進行家系分析和遺傳咨詢，有利于提高出生人口素質。但基因檢測操作復雜、技術具有局限性、檢測周期長、價格昂貴，不適用于大規模的新生兒疾病篩查。