基于石墨烯和功能核酸的Ag+熒光檢測方法

吳雪琪 張立佩 曹陽 文曉剛 周小紅

（1. 上海師范大學(xué)環(huán)境與地理科學(xué)學(xué)院，上海 200234；2. 清華大學(xué)環(huán)境學(xué)院環(huán)境模擬與污染控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100084；3. 嘉興學(xué)院南湖學(xué)院，嘉興 314001）

近年來，銀作為一種抗菌劑在醫(yī)院得到廣泛的使用，特別是在傷口敷料、外用制劑和醫(yī)療器械（氣管內(nèi)呼吸管、骨假體等）中。然而，長期接觸銀和銀化合物會(huì)導(dǎo)致銀質(zhì)沉淀癥及其他癥狀，如頭痛、胃痛、疲勞、皮膚刺激或更嚴(yán)重的神經(jīng)、腎臟或肝臟并發(fā)癥。膠體銀還可能干擾某些藥物的吸收，如培那西拉敏、喹諾酮類、四環(huán)素和甲狀腺素。由于人類對(duì)銀的接觸越來越普遍，因此需要開發(fā)一種簡單快速的方法來監(jiān)測水源和體內(nèi)的銀［1-2］。

大量研究表明，在分子水平上某些重金屬離子可與特定的基因序列發(fā)生作用，使其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變［3］，而這種結(jié)構(gòu)和性能的關(guān)系使重金屬離子，如Ag+、Hg2+的快速、特異識(shí)別有了一條便捷的途徑。上述能夠發(fā)生特異結(jié)構(gòu)變化的DNA或RNA鏈，被稱為功能核酸［4］，它們通過3種類型的傳感方式實(shí)現(xiàn)重金屬離子的檢測：第一種是利用DNA，基因錯(cuò)配特異性結(jié)合重金屬離子實(shí)現(xiàn)檢測［5］。本課題組報(bào)道了基于Hg2+與T堿基錯(cuò)配形成T-Hg2+-T復(fù)合物的倏逝波定量檢測Hg2+的研究，對(duì)Hg2+的檢測限為2.1 nmol/L［6］；第二種是與鳥嘌呤（G）-四聯(lián)體發(fā)生特異性反應(yīng)，G-四聯(lián)體是由ssDNA（單鏈DNA）中的多個(gè)G-4面互相重疊而產(chǎn)生，重金屬離子可進(jìn)入G-四聯(lián)體的中心，從而影響其與其他離子結(jié)合［7-8］；第三種是基于金屬依賴性的核酸酶DNAzyme，即在特定重金屬離子的存在下，DNAzyme催化發(fā)生水解斷裂反應(yīng)，不可逆地將帶有熒光標(biāo)記的核酸片段剪斷，從而實(shí)現(xiàn)檢測［9］。目前依據(jù)這些傳感設(shè)計(jì)思路已經(jīng)用于多種重金屬的單指標(biāo)甚至多指標(biāo)的同時(shí)測定。最常見的傳感策略是基于熒光體（供體）和猝滅劑（受體）之間的能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）［10］。然而，傳統(tǒng)的基于熒光生物傳感的方法需要在DNA鏈上修飾兩種或更多的猝滅劑以降低背景信號(hào)。因此，尋找不含標(biāo)記物或含有較少標(biāo)記物的熒光染料或猝滅材料是適配體的發(fā)展方向。

近幾年，納米技術(shù)取得飛速發(fā)展，納米材料也成為很有發(fā)展前景的生物分析材料。石墨烯是一種單層碳原子通過sp2雜化形成二維蜂窩狀點(diǎn)陣結(jié)構(gòu)的二維碳納米材料［11-12］，這種特殊的單層碳原子結(jié)構(gòu)決定石墨烯材料具有特別的物理和化學(xué)性質(zhì)［13-14］。同時(shí)石墨烯特殊的結(jié)構(gòu)決定其可與生物大分子尤其是DNA分子相互作用，從而為構(gòu)建新型化學(xué)和生物傳感器奠定了基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，單鏈DNA和雙鏈DNA在石墨烯上具有不一樣的結(jié)合能力，而且石墨烯可以作為優(yōu)異的能量或電子受體猝滅發(fā)光材料的熒光［15-16］，由此可以選擇性的吸附和猝滅有熒光標(biāo)記的單鏈（ss-）DNA探針。其作為猝滅劑的優(yōu)點(diǎn)包括無需標(biāo)記到DNA上，長距離熒光猝滅效應(yīng)，低背景噪聲等［17］。因此如果能以石墨烯作為新的信號(hào)傳導(dǎo)基體，無疑將為目標(biāo)物的快速、高靈敏和高通量檢測提供新的思路。

本實(shí)驗(yàn)利用石墨烯對(duì)單鏈DNA和雙鏈DNA不一樣的連接能力，以及其優(yōu)異的熒光猝滅能力，結(jié)合適配體錯(cuò)配原理，設(shè)計(jì)開發(fā)了C-Ag+-C和石墨烯的新型熒光傳感器用于快速和高靈敏檢測Ag+。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料及來源 硝酸銀（AgNO3），氫氧化鈉（NaOH）：分析純，北京化工廠（北京）；氧化石墨烯（GO）：先豐納米科技有限公司（南京）；熒光基團(tuán)FAM修飾的Ag+適配體：DNA探針（SSO-FAM，5'-FAM-CTC TCT TCT CTT CAT TTT TCA ACA CAA CAC AC-3'，該 探 針 設(shè) 計(jì) 參 考 了Ono等［18］，Wen等［19］的研究），上海生工生物科技有限公司（上海）；HEPES：4-羥乙基哌嗪乙磺酸；N-（2-羥乙基）哌嗪-N’-2-乙烷磺酸，1M溶液，Mediatech公司（美國）；SDS：十二烷基硫酸鈉，≥95.0%，拜爾迪生物技術(shù)有限公司（北京）。

1.1.2 儀器 F-7000熒光分光光度計(jì)（Hitachi，日本）；pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司，中國）；CF16RX II離 心 機(jī)（Hitachi，日 本）；MTC-100恒溫混勻儀（南京戶川電子，中國）；超純水：Barnstead，NANOpure Dlamond，≥18.2MΩ。

1.1.3 溶液配制 0.5 g/L的GO溶液：稱取0.25 g GO，用超純水定容至500 mL，以200 W的功率超聲4 h以上（控制溫度不超過40℃）（溶液在使用前需再超聲10 min）。

1 μmol/L的SSO-FAM溶液：先將引物以12 000 r/min離心2 min，加入35 μL的超純水定容，配成100 μmol/L的儲(chǔ)備液，使用時(shí)再稀釋到合適濃度。

100 μmol/L和1 μmol/L的AgNO3溶液：準(zhǔn)確稱取AgNO3粉末1.698 7 g，加少量超純水溶解，定容至10 mL，混合均勻，濃度即為100 mol/L。

1 mol/L的NaNO3溶液：稱取NaNO3粉末8.499 g，取少量水溶解，定容至100 mL濃度即為1 mol/L。

1 mol/L的HEPES溶液：購得。

1.2 方法

1.2.1 可行性分析 分別測試SSO-FAM體系，SSOFAM-GO體系，以及在SSO-FAM-GO體系下加入不同濃度Ag+的熒光強(qiáng)度。

1.2.2 GO超聲時(shí)間優(yōu)化 GO溶液對(duì)SSO的猝滅效率有至關(guān)重要的作用，影響Ag+檢測的信噪比，是實(shí)現(xiàn)Ag+檢測的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)將不同濃度的GO溶液在超聲0 min、10 min和30 min后加入SSOFAM溶液中，測定其熒光強(qiáng)度，并計(jì)算熒光猝滅效率。

1.2.3 SSO-FAM和GO反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化 SSO-FAM和GO的反應(yīng)時(shí)間會(huì)的熒光信號(hào)產(chǎn)生影響，將終濃度為10 nmol/L的SSO-FAM溶液和10 mg/L的GO溶液的反應(yīng)時(shí)間設(shè)置為0 min、10 min、20 min、30 min、40 min，檢測熒光強(qiáng)度，觀察反應(yīng)時(shí)間對(duì)GO熒光猝滅效率的影響。

1.2.4 SSO-FAM與GO溶液反應(yīng)用量的優(yōu)化 選取3組不同比例的SSO-FAM溶液和GO溶液，第1組為終濃度10 nmol/L的SSO-FAM溶液和10 mg/L的GO溶液，第2組為終濃度20 nmol/L的SSO-FAM溶液和10 mg/L的GO溶液，第3組為終濃度20 nmol/L的SSO-FAM溶液和20 mg/L的GO溶液，將不同濃度的Ag+加入上述3組溶液中，測定熒光強(qiáng)度。

1.2.5 Ag+的檢測方法 將20 μL 1 μmol/L的DNA探針溶液與0-800 nmol/L不同濃度梯度的Ag+溶液混合均勻，將10 μL 1 mol/L HEPES溶液和50 μL 1 mol/L的NaNO3溶液加入上述溶液中，定容體積為1 mL，pH 7.10，37℃下避光反應(yīng)20 min，生成C-Ag+-C的復(fù)合物。然后再加入終濃度為20 mg/L的GO，混合反應(yīng)10 min，以494 nm的激發(fā)波長檢測熒光信號(hào)。

1.2.6 其他金屬離子的干擾測定 保持反應(yīng)條件不變，將1 μmol/L Cd2+、Pb2+、Hg2+等金屬離子作為干擾離子加入樣品中，檢測各金屬離子的熒光強(qiáng)度。

1.2.7 Ag+的加標(biāo)回收試驗(yàn) 使用熒光分光光度計(jì)檢測200-500 nmol/L不同濃度梯度的Ag+溶液的熒光強(qiáng)度，根據(jù)樣品濃度與測得的熒光強(qiáng)度建立Ag+標(biāo)準(zhǔn)曲線；使用飲用水配制樣品溶液，并將一定濃度的Ag+加入樣品中，檢測加入Ag+后樣品的熒光強(qiáng)度，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)曲線的熒光信號(hào)對(duì)照，計(jì)算樣品加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果

2.1 可行性分析

為了證明該傳感器設(shè)計(jì)的合理性，我們考察了各體系的熒光光譜。如圖1所示，當(dāng)體系中不存在Ag+時(shí)，SSO修飾的FAM熒光被一定量的石墨烯完全猝滅，表明單鏈DNA與石墨烯之間存在π-π作用力；當(dāng)Ag+存在時(shí)，該體系表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光，說明Ag+能夠與兩個(gè)胞嘧啶堿基結(jié)合，使SSO折疊成為穩(wěn)定的分子內(nèi)C-Ag+-C雙鏈結(jié)構(gòu)，減弱了與石墨烯之間的作用力，從而使該體系的熒光得到恢復(fù)，并且加入濃度越高，熒光恢復(fù)強(qiáng)度越大，由此證明Ag+檢測的可行性。

圖1 不同條件下SGI的熒光強(qiáng)度

2.2 GO超聲時(shí)間優(yōu)化結(jié)果

實(shí)驗(yàn)對(duì)比了不同濃度的GO溶液在不同超聲時(shí)間下對(duì)SSO-FAM的猝滅效率的影響。結(jié)果如圖2所示。未經(jīng)超聲處理的GO溶液，即使增加溶液的濃度到30 mg/L時(shí)，其猝滅效率依然低于30%；當(dāng)GO經(jīng)過分別10 min和30 min超聲處理后，10 mg/L的GO添加量就可達(dá)到95%的猝滅效率，說明GO在使用前需要進(jìn)行10 min以上的超聲處理。

圖2 GO超聲時(shí)間對(duì)其熒光猝滅效率的影響

2.3 SSO-FAM和GO反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果

將 10 nmol/L的DNA探針溶液和10 mg/L的氧化石墨烯溶液設(shè)置0-40 min的反應(yīng)時(shí)間，觀察熒光猝滅效果，結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DNA探針溶液和氧化石墨烯溶液的熒光強(qiáng)度隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而下降，20 min后熒光強(qiáng)度出現(xiàn)回升，40 min與10 min處的熒光強(qiáng)度基本相同，說明Ag+與SSO錯(cuò)配反應(yīng)充分。因此，本實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為10 min。

圖3 反應(yīng)時(shí)間對(duì)GO熒光猝滅效率的影響

2.4 SSO-FAM與GO溶液反應(yīng)用量的優(yōu)化結(jié)果

考察了3組比例不同的DNA探針溶液和石墨烯溶液對(duì)Ag+熒光測試的影響，結(jié)果如圖4所示。其中，曲線1為10 nmol/L的DNA探針溶液和10 mg/L的石墨烯溶液的混合溶液。在加入的Ag+濃度低于100 nmol/L時(shí)，檢測出的熒光強(qiáng)度出現(xiàn)下降，加入的Ag+濃度超過100 nmol/L時(shí)，樣品的測試值出現(xiàn)上升，但穩(wěn)定性差，并且上升緩慢；曲線2為20 nmol/L的DNA探針溶液和10 mg/L的石墨烯溶液的混合溶液，在加入的Ag+濃度低于200 nmol/L時(shí)，測試出的熒光強(qiáng)度不斷下降，這是由于石墨烯的用量不足未能將熒光完全猝滅，當(dāng)添加的Ag+濃度超過200 nmol/L后，檢測出的熒光強(qiáng)度隨著Ag+濃度上升；曲線3為終濃度20 nmol/L的DNA探針溶液和20 mg/L的石墨烯溶液的混合溶液，熒光強(qiáng)度從50 nmol/L開始出現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，當(dāng)Ag+濃度大于800 nmol/L后，檢測出的熒光強(qiáng)度逐漸趨于穩(wěn)定。根據(jù)3組實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，曲線3的樣品信噪比低，且檢測的線性范圍最寬，因此實(shí)驗(yàn)選用20 nmol/L的DNA探針溶液和20 mg/L的石墨烯溶液作為最佳比例的反應(yīng)用量。

圖4 SSO濃度對(duì)Ag+檢測的影響

2.5 Ag+的檢測結(jié)果

在最優(yōu)的條件下，熒光增強(qiáng)強(qiáng)度與Ag+濃度在150 nmol/L-400 nmol/L濃度范圍呈線性相關(guān)（圖5），校正曲線方程為F= 0.917 3CAg-80.006，相關(guān)系數(shù)為0.991，按照IUPAC定義的檢出限（LOD）計(jì)算方法求得檢出限（3 σ）為23 nmol/L。

2.6 其他金屬離子的干擾測定

為了驗(yàn)證本方法適用于復(fù)雜水體中的Ag+濃度的測試，通過實(shí)驗(yàn)測試了幾種常見的金屬離子在本方法下的熒光強(qiáng)度響應(yīng)。將1 μmol/L的Fe3+、Zn2+、Mg2+、Pb2+、Co2+、Ni2+、Cd2+、Hg2+、Ca2+、Mn2+和Cu2+加入DNA探針與石墨烯的混合體系中，保持其他的方法不變，檢測不同金屬離子的熒光強(qiáng)度，結(jié)果如圖6所示。200 nmol/L的Ag+的樣品熒光強(qiáng)度為240，其他金屬離子的熒光強(qiáng)度都低于50，不足Ag+的1/10。結(jié)果顯示，本方法對(duì)于Ag+具有特異性，適用于復(fù)雜水體。

2.7 樣品Ag+加標(biāo)檢測

進(jìn)一步將該探針用于自來水中Ag+的檢測，該樣品中未檢測出Ag+，向這些樣品中加入300 nmol/L的Ag+，其回收率為96.6%，證明該方法對(duì)于實(shí)際樣品分析具有一定的指導(dǎo)意義。

圖5 不同濃度Ag+對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度

圖6 選擇性分析

3 討論

有些核酸探針的信號(hào)單元同時(shí)包括了染料分子和納米材料，這類探針稱為核酸-染料/納米探針［23］。該探針多數(shù)是通過染料分子和納米材料之間的FRET效應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。以石墨烯納米材料為例，如Yang課題組首先利用石墨烯對(duì)單鏈DNA和雙鏈DNA吸附能力的不同，實(shí)現(xiàn)了DNA分子的檢測［16］。檢測機(jī)理如下：染料標(biāo)記的單鏈DNA探針可以通過π-π作用力與石墨烯結(jié)合，從而拉近染料和石墨烯之間的距離，導(dǎo)致二者發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移，染料熒光發(fā)生猝滅，當(dāng)目標(biāo)物DNA存在時(shí)，可以與探針分子雜交形成雙鏈DNA，從而減弱了核酸與石墨烯之間的作用力，阻礙了能量共振轉(zhuǎn)移的發(fā)生，體系熒光得以恢復(fù)［24］。本研究傳感原理，如圖7所示，重金屬離子可與特定的基因序列發(fā)生作用［25］，當(dāng)體系中無Ag+存在時(shí)，由于堿基與石墨烯之間的π-π作用力，單鏈DNA與石墨烯形成石墨烯/單鏈DNA復(fù)合物，此時(shí)FAM與石墨烯之間發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移，其熒光猝滅。當(dāng)體系中加入Ag+時(shí)，由于Ag+能夠選擇性的與兩個(gè)胞嘧啶堿基結(jié)合，使得DNA發(fā)生構(gòu)型變化折疊成為穩(wěn)定的分子內(nèi)C-Ag+-C雙鏈結(jié)構(gòu)［26］，由于空間位阻的存在，此時(shí)加入的石墨烯不會(huì)與產(chǎn)物發(fā)生相互作用，因此FAM的熒光不能被有效猝滅，因此可以通過傳感器的熒光增強(qiáng)程度對(duì)體系中加入的Ag+進(jìn)行定量檢測［27］。

將本研究結(jié)果與利用納米材料和富C堿基DNA探針檢測Ag+的部分已報(bào)道研究進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果如表1所示。可以看出，本實(shí)驗(yàn)方法的線性范圍和檢出限與其他方法相比各有優(yōu)劣，與同樣使用氧化石墨烯的方法相比，本研究所建立的核酸傳感器對(duì)Ag+的檢測線性范圍更大。

圖7 利用GO和SSO-FAM檢測Ag+的原理示意圖

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于核酸適配體錯(cuò)配反應(yīng)的原理，利用SSO-FAM和GO建立了一種對(duì)Ag+檢測的方法。使用本方法，在150-400 nmol/L范圍內(nèi)Ag+濃度和熒光強(qiáng)度檢測值呈線性關(guān)系，Ag+的檢測限可達(dá)23nmol/L。該方法在飲用水的實(shí)驗(yàn)樣品中Ag+加標(biāo)檢測的回收率達(dá)到96.6%，對(duì)飲用水中Ag+含量的檢測具有一定的指導(dǎo)意義。但是該方法線性范圍較窄，并未達(dá)到預(yù)期結(jié)果，在方法設(shè)計(jì)和實(shí)際檢測方面還有待進(jìn)一步的改進(jìn)。

表1 本研究方法與其他方法的性能對(duì)比