豬圓環病毒Ⅱ型與豬繁殖呼吸障礙綜合征混合感染的診斷

王浩先，白金洋，張 穎，倪宏波

(1.黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319； 2.青島農業大學)

豬圓環病毒屬圓環病毒科，圓環病毒屬，是一種直徑17 nm的小型，無囊膜的單股負鏈環狀DNA病毒，分為兩種不同的基因型(PCV-Ⅰ和PCV-Ⅱ)[1]。PCV-Ⅱ感染所致的臨床癥狀主要有5種[2]，即豬斷奶后多系統衰弱綜合征(PMWS)、豬腎病與皮炎綜合征(DNS)、豬呼吸疾病綜合征(PRDC)、豬繁殖障礙(PRF)和傳染性先天性震顫(CT)。PCV-Ⅱ是斷奶多系統消耗綜合征(PMWS)的主要病因，其特征是進行性消瘦，呼吸障礙，腎病綜合征和先天性震顫[3]。此外，由于PCV-Ⅱ是免疫抑制病毒，因此患病豬更容易受到其他病毒和細菌的侵害。

豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)又稱藍耳病，由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道疾病為特征的烈性傳染病。引起該病的病原是豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)[4,5]。豬群感染PRRSV的臨床癥狀因不同生長階段或輕重程度表現各異。主要的臨床表現有流產、病毒血癥與發熱、分娩障礙、拒食、母豬死亡、仔豬帶毒、斷奶前死亡率增加、弱仔。嚴重程度與豬群的應激狀況、并發感染、管理水平及病毒型等相關[5]。

1 材料與方法

1.1病料來源 安達市某規模化養豬場80余頭40日齡斷奶仔豬，生長遲緩，嚴重消瘦，精神沉郁，食欲下降或廢絕，全身被毛粗亂，皮膚蒼白，呼吸急促，偶有咳嗽和喘氣，曾發生嘔吐和腹瀉。有豬瘟和偽狂犬的疫苗免疫史。

1.2送檢樣本 安達市某規模化豬場送檢的一頭40日齡患病豬，無菌采集患病豬肝、肺、脾、腎及小腸。

1.3檢測試劑 MgCl2、10×Buffer、DL 2000 DNA Marker、dNTP、Taq DNA聚合酶(均購自大連寶生物工程有限公司)、TIAN amp Genomic DNA Kit DNA提取試劑盒(購自TIANGEN公司)、RNA simple Total RNA Kit RNA提取試劑盒(購自TIANGEN公司)、Maxima H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit 反轉錄試劑盒購自Thermo Fisher Scientific-CN公司、生理鹽水、去離子水、DEPC水、消化液、蛋白酶K、酚、酚-氯仿-異戊醇、氯仿-異戊醇、無水乙醇等。

1.4引物設計 參考GenBank中公開發表的豬瘟病毒(HC)、豬普通致病性豬藍耳病(PRRS)、豬圓環病毒 Ⅱ型(PCV Ⅱ)、豬偽狂犬病毒(PR)的基因序列及相關文獻設計特異性上下游引物。

1.5核酸提取及鑒定

1.5.1病料處理 無菌取各臟器小塊病料，加DEPC水2 mL置于研磨管研磨，將研磨后的樣品置于-20℃保存備用。

1.5.2組織DNA提取 使用TIANamp Genomic DNA Kit血液/細胞/組織基因DNA提取試劑盒，按說明書操作步驟提取組織總DNA，-20℃保存備用。

1.5.3組織RNA提取 使用RNAsimple Total RNA Kit 總RNA提取試劑盒，按說明書操作步驟提取組織總RNA，-20℃保存備用。

1.5.4RNA反轉錄 使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄盒，按說明書操作步驟將病毒提取的RNA反轉錄成cDNA，得到的cDNA在-20℃進行保存備用。

1.5.5PCR擴增及核酸電泳 用得到的DNA和cDNA為模板，圓環病毒及藍耳病毒特異性引物進行PCR反應擴增。取5 μL的擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結果與分析

2.1剖檢變化 病豬有腹膜炎和間質性肺炎癥狀、胸腔積液，肺臟出現間質性肺炎癥狀，胃腸鼓氣、胃底部有多量出血點(圖1)，腎臟外觀灰紅色，表面有結節、小出血點，切面有多量出血點，脾頭嚴重腫大，邊緣增寬，淡紅黃色，有出血點(圖2)，進一步切開后可見盲腸的回盲口部分有輕度的充血和腫脹，腸壁增厚，小腸腸粘膜有褶皺(圖3)。

圖1 胃底部出血點

圖2 脾頭腫大增寬

圖3 腸粘膜褶皺

2.2PCR結果 PCR檢測結果表明，在PCR擴增圖的PCV中有880 bp左右的條帶，與豬圓環病毒預期片段大小相符，在PCR擴增圖的PRRSV中有300 bp左右的條帶，與豬藍耳病病毒預期片段大小相符(圖4)。

圖4 PCR擴增圖

2.3細菌學檢查 取病豬肺、肝、脾接種血瓊脂培養基，37℃培養24 h，未見細菌生長。

2.4分析 根據PCR結果，判定為豬圓環病毒Ⅱ型和豬藍耳病病毒混合感染。但剖檢時藍耳病癥狀相對較輕，根據該豬場既往病史，認定為隱形帶毒狀態的僵豬。剖檢時發現腸壁增厚，小腸腸粘膜有褶皺，懷疑亦有豬慢性增生性腸炎混合感染，但細菌學檢查后未發現致病菌感染。

3 討論

3.1豬圓環病毒Ⅱ型感染一般會出現淋巴結病變，有不同程度的出血。腎臟出現病變，腎臟腫大、出血、有灰白色斑。脾臟病變，現為腫大、邊緣出血，有少部分不發生腫大、質地變脆。胸腹水和彌漫性肺炎也是觀察到的重要病理變化，病例可見肝臟花斑狀條紋，腸或結腸黏膜充血、淤斑[6]。

3.2豬藍耳病毒感染主要為各年齡的豬淋巴結腫大灰白色與肌肉灰白水腫，出血性肺炎和間質性肺炎。組織學變化，支氣管上皮細胞纖毛的套管樣脫落，肺巨噬細胞的活化增生。

3.3目前一般認為，PRRSV與PCV-2單獨感染均不會導致豬大批發病死亡，但是它們常常混合感染，或與其他病原混合感染會導致死亡率升高，危害較大。因PCV-2與PRRSV均會使動物機體免疫機能下降，如有繼發感染會造成大批仔豬死亡，經濟損失較大， 故應采取綜合防制措施[7]。豬圓環病毒病與高致病性豬藍耳病都是一種免疫抑制疾病，病原可破壞機體的免疫系統，導致機體抗病力降低。 PCV-Ⅱ經常與PRRSV、豬偽狂犬病毒、副嗜血桿菌等病原發生混合感染或繼發感染，如果豬場發病后，疫情會更加嚴重，病死率也大大增加。當PCV-Ⅱ與PRRSV同時感染時，PRRSV可以促進PCV-Ⅱ在體內的增殖。目前對豬圓環病毒病的防制主要是使用滅活疫苗對豬群進行免疫預防，同時結合生物安全、飼養管理和藥物預防等綜合防控措施，已達到防治該病的目的。

3.4加強飼養管理方面需要飼養場所保持環境的清潔，保證圈舍的通風性能良好，降低氨氣等有毒有害氣體的影響，養豬場的飼養密度要適當，不能追求經濟效益而過度養殖，以免增加PRRSV和PCV-Ⅱ等疾病的發病概率。對陽性豬圈要進行嚴格、徹底的殺菌消毒，抑制傳染源，以避免病毒感染擴大出現較大疫情[8]。