炔諾酮對斑馬魚腸道免疫調節因子的干擾效應

梁燕秋，司徒艷結，董忠典，許文強，梁杏儀，景占鑫

炔諾酮對斑馬魚腸道免疫調節因子的干擾效應

梁燕秋1，司徒艷結1，董忠典2，許文強1，梁杏儀1，景占鑫1

（1. 廣東海洋大學化學與環境學院，廣東 湛江 524088；2. 廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088）

【】研究孕激素炔諾酮對斑馬魚 () 腸道免疫調節因子的干擾效應。將成年斑馬魚分別在含0、7、84和810 ng/L炔諾酮的水環境中暴露90 d，分析炔諾酮對斑馬魚腸道組織中核轉錄因子κB（NF-κB），細胞因子α干擾素（IFN-α）、白細胞介素1α（IL-1α）、白細胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等含量的影響。炔諾酮主要在810 ng/L時顯著提高雌魚腸道組織中IFN-α、IL-1α和TNF-α含量，以及雄魚腸道組織中NF-κB、IFN-α、IL-1α、IL-1β和TNF-α含量。炔諾酮可激活斑馬魚腸道組織中NF-κB信號通路，促進細胞因子的分泌，從而誘導斑馬魚腸道發生炎癥反應。

斑馬魚；腸道免疫；炔諾酮；孕激素；干擾；細胞因子；核轉錄因子κB

孕激素是一種類固醇激素，廣泛用于人類避孕藥物以及治療激素引起的各項疾病[1-3]，還廣泛用于畜牧業，以提高動物產量和增肥[4-5]。這導致受納環境存在不同濃度的孕激素[2,6]，其中炔諾酮（Norethindrone，NET）在加拿大和馬來西亞污水處理廠出水中質量濃度高達159和188 ng/L[7-8]，在中國養豬場沖刷水中質量濃度達143 ng/L[9]。美國受廢水排放河流中檢測出高濃度NET (872 ng/L)[10]。水環境中殘留的NET會對生物的生長發育和生殖系統產生不良影響。已有文獻報道，NET可抑制黑頭呆魚（）和日本青鳉（）產卵量[11]，可引起雌魚發生雄性化[11-12]，還可改變斑馬魚性別比例，導致更多雄魚產生[13]。此外，黑頭呆魚早期發育階段暴露于NET可抑制其存活和生長[14]。筆者亦報道，斑馬魚（）長期暴露于NET會抑制生長，抑制卵巢成熟，誘導精巢發育，改變與生殖相關基因的轉錄表達水平[15]。迄今，關于孕激素對生物免疫功能和炎癥反應的研究主要集中于對人類和哺乳動物的干擾效應[16-18]。然而，關于孕激素NET對生物免疫系統干擾效應，尤其是對魚類腸道免疫調節因子的干擾效應研究未見報道。

魚類腸道黏膜層不僅是消化吸收營養物質的場所，還是機體內復雜的免疫組織[19]，通過腸道相關淋巴組織（Gut-associated lymphoid tissues，GALT）發揮免疫防御和免疫調節作用。GALT含有許多巨噬細胞、漿細胞、淋巴細胞等免疫細胞。免疫細胞受到一些刺激物誘導后，可分泌調節細胞功能的小分子可溶性蛋白——細胞因子[20]。細胞因子可促進細胞生長分化和免疫系統發育，對機體免疫功能有重要調節作用。在斑馬魚中，細胞因子研究主要包括α干擾素（Interferon α，IFN-α）、白細胞介素1α（Interleukin 1α，IL-1α）、白細胞介素1β（Interleukin 1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）等，可通過激活核轉錄因子κB（Nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號通路調控這些細胞因子的產生[21]。這些免疫調節因子是炎癥反應的重要組成部分。

筆者研究成年斑馬魚長期暴露于低劑量NET后，腸道NF-κB、IFN-α、IL-1β、IL-1α和TNF-α等5種免疫調節因子的變化，探究NET對斑馬魚腸道細胞免疫影響，為評價孕激素的生態健康風險提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗化合物

NET購于德國TRC公司，純度≥98%，取25 mg的NET溶于二甲基亞砜（DMSO），制成質量濃度為100 mg/L的母液，放置- 20 ℃下待用。

1.2 實驗魚類

健康的成年斑馬魚飼養在廣東海洋大學水生毒理實驗室，水溫（26±1）℃，水的氧飽和度大于70％，pH控制在7 ~ 8，光暗周期14 h:10 h。每天上午和下午投喂新孵化的鹵蟲（）。

1.3 暴露實驗設計

選取20 L的魚缸作為暴露容器，暴露水體積為12 L，水體中NET未檢出。設置12缸，每缸隨機放入雌、雄健康斑馬魚各8尾，雄魚全長（3.67 ± 0.18）cm、體質量（0.37 ± 0.06）g，雌魚全長為（3.60 ± 0.13）cm、體質量（0.31 ± 0.03）g。根據文獻[7-10]報道以及普通河流中的NET濃度[6]，暴露實驗設置10、100、1 000 ng/L 3個質量濃度組和一個溶劑對照組（體積分數0.001% DMSO），各組設3個平行組。所有NET暴露組均含有體積分數0.001% DMSO助溶劑。暴露期間，每48 h換水1次。飼養條件同1.2，并用虹吸管吸走糞便及食物殘渣。暴露期間，每周測定水體pH值、溶解氧、電導率等參數，每天統計斑馬魚死亡數量。在暴露90 d后，將斑馬魚至于冰上麻醉、解剖，無菌采集腸道組織，立即放入液氮中速凍，然后轉入-80 ℃下保存。

1.4 腸道免疫因子分析

對每個平行中收集的所有腸道組織稱取質量，加入500 μL生理鹽水，勻漿，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，根據酶聯免疫試劑盒（上海酶聯生物有限公司）說明書方法測定斑馬魚腸道組織中NF-κB、IFN-α、IL-1β、IL-1α和TNF-α等免疫調節因子的含量。

1.5 暴露溶液中NET的測定

所有處理組水樣在暴露50、86 d的換水后（0）和換水前（48）采集。水樣分析方法參考文獻[9, 15]。從每個平行中收集1 L水樣，每個處理組3個平行，共12個水樣，使用固相萃取柱（Waters HLB，6 mL，500 mg）富集水樣中NET，用9 mL色譜純的乙酸乙酯對固相萃取柱進行洗脫。將收集的洗脫液放在緩慢吹出的氮氣氣流中吹干乙酸乙酯。用1 mL色譜純的甲醇將氮吹后殘留在玻璃管中的物質重新溶解，隨后密封于2 mL進樣小瓶，置于-20 ℃中避光保存，備測。采用高效液相色譜串聯質譜（RRLC-MS/MS）（Agilent 1290 LC-Agilent 6460 QQQ, USA）測定NET濃度。NET檢測限和回收率分別為0.02 ~ 0.24 ng/L和72% ~ 107%[9]。NET在3個處理組的實測質量濃度分別為7、84和810 ng/L，溶劑控制組未測到NET。下文以NET的實測濃度表示。

1.6 數據分析

所得數據以平均數±標準差的形式來表示，采用Spss13.0進行數據處理和統計分析，并用OriginPro 2016作圖。采用單因素ANOVA檢驗分析方法中的Tukey多重比較法分析溶劑對照組與NET處理組免疫調節因子含量差異的顯著性，≤0.05（*）、≤0.01（**）、≤0.001（***）時，差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NET對斑馬魚腸道組織中NF-κB含量的影響

斑馬魚雌魚和雄魚腸道組織中NF-κB含量測定結果如圖1所示。NET在7和84 ng/L時對雌性斑馬魚腸道中NF-κB含量無顯著影響，在810 ng/L時NF-κB平均值提高，但與對照組無顯著性差異（圖1A）。在雄魚腸道組織中，NET在7 ng/L時NF-κB含量平均值低于對照組，但與對照組無顯著性差異（圖1B）；NET在810 ng/L時顯著提高雄魚腸道組織中NF-κB含量（< 0.05），但在84 ng/L時沒有改變NF-κB水平（圖1B）。

圖1 不同濃度NET處理90 d后斑馬魚腸道組織中NF-κB含量變化

2.2 NET對斑馬魚腸道組織中IFN-α含量的影響

雌性和雄性斑馬魚腸道組織中IFN-α含量測定結果如圖2所示。雌魚腸道中，7和84 ng/L暴露組IFN-α含量平均值較對照組有一定提高，但變化無統計學意義（圖2A）；NET在810 ng/L時顯著提高腸道IFN-α水平（< 0.01）（圖2A）。在雄魚腸道組織中，IFN-α含量在7 ng/L時有下降趨勢，但差異無統計學意義（圖2B）；NET在84 ng/L時未改變腸道IFN-α水平，但在810 ng/L時顯著提高IFN-α含量（< 0.05）（圖2B）。

圖2 不同濃度NET處理90 d后斑馬魚腸道組織中IFN-α含量變化

2.3 NET對斑馬魚腸道組織中IL-1α含量的影響

雌、雄性斑馬魚腸道組織中IL-1α含量測定結果見圖3。雌魚腸道中，隨NET暴露濃度的上升，IL-1α含量平均值不斷升高（圖3A），但僅在810 ng/L時顯著提高IL-1α含量水平（< 0.05）（圖3A）。雄魚腸道中，NET在7和84 ng/L時IL-1α含量無顯著變化，在810 ng/L時顯著提高IL-1α含量(<0.001)(圖3B)。

圖3 不同濃度NET處理90 d后斑馬魚腸道組織中IL-1α含量變化

2.4 NET對斑馬魚腸道組織中IL-1β含量的影響

圖4可見，在雌魚腸道中，各組IL-1β含量差異無統計學意義，僅在7 ng/L NET處理組有下降趨勢（圖4A）。在雄魚腸道組織中，NET暴露在7 ng/L時顯著降低IL-1β含量（<0.01），在810 ng/L時亦顯著提高了IL-1β水平（<0.05），而在84 ng/L時IL-1β含量，但無明顯變化（圖4B）。

圖4 不同濃度NET處理90 d后斑馬魚腸道組織中IL-1β含量變化

2.5 NET對斑馬魚腸道組織中TNF-α含量的影響

雌、雄斑馬魚魚腸道組織中TNF-α含量測定結果如圖5所示。在雌魚腸道組織中，隨著NET暴露濃度不斷提高，TNF-α含量平均值不斷提升，在810 ng/L時TNF-α水平有統計學意義（<0.01）（圖5A）。在雄魚腸道組織中，NET僅在810 ng/L時顯著提高TNF-α水平（<0.001），在7、84 ng/L NET處理組TNF-α含量差異無統計學意義，但7 ng/L組平均值有所下降（圖5B）。

圖5 不同濃度NET處理90 d后斑馬魚腸道組織中TNF-α含量變化

3 討論

本研究表明，NET主要在高濃度組（810 ng/L）對腸道組織中NF-κB、IFN-α、IL-1α、IL-1β和TNF-α產生顯著影響，提高了它們的含量，對腸道免疫系統有潛在的干擾效應。

核轉錄因子κB（NF-κB）蛋白家族參與免疫細胞活化和組織應激性反應，在生物中廣泛存在[20,22]。NF-κB可調控細胞因子的產生，在細胞的免疫應答和炎癥反應中起關鍵作用。本研究發現，NET在最高濃度組誘導了雄魚腸道組織NF-κB的表達，且對雌魚腸道組織NF-κB水平也有提高趨勢，進而調控細胞因子IFN-α、IL-1α、IL-1β和TNF-α的產生。本研究也檢測到這些細胞因子含量在NET處理下顯著上升。

干擾素（IFN）是一種特殊的分泌蛋白或糖蛋白，是人體或動物機體對環境中各種刺激（包括病毒）而產生的，通過調節干擾素刺激基因的轉錄表達來達到發揮抗病毒的作用[23]。干擾素有較強的免疫調節、抗腫瘤、抗病毒能力，主要包括IFN-α、IFN-β、IFN-γ三類。研究發現，病毒的感染可誘導斑馬魚IFN的表達，誘導斑馬魚的免疫應答[24]。本研究中，NET在810 ng/L時顯著誘導了雌、雄斑馬魚腸道組織中IFN-α表達，表明環境中殘留的NET可誘導斑馬魚腸道干擾素的產生，從而對環境中NET做出免疫應答效應，保護斑馬魚免受NET的污染，有潛在抗污染能力。

白細胞介素（IL）是一類由免疫細胞或白細胞產生且在免疫應答中發揮極為重要作用的糖蛋白。可參與炎癥反應，促進炎癥的產生[25]，魚類體內存在IL-1α與IL-1β兩種類型的分子。本研究發現，高濃度組NET主要提高了IL-1α和IL-1β的含量，暗示NET可加劇斑馬魚腸道組織的炎癥反應，防止機體受外來物質的干擾。值得注意的是，NET在極低濃度時（7 ng/L）可降低雄魚腸道組織IL-1β含量，可能與暴露濃度有關，具體原因有待進一步研究。

腫瘤壞死因子（TNF）是具有生物活性的細胞因子，主要分為TNF-α和TNF-β兩種亞型，TNF-α由單核巨噬細胞產生，而TNF-β由T細胞產生。斑馬魚TNF主要是由活化的巨噬細胞所分泌的TNF-ɑ亞型，已有研究顯示，斑馬魚體內的TNF-ɑ與哺乳動物體內的TNF-ɑ相似[20, 26]，因而重點研究TNF-ɑ在斑馬魚腸道中的表達量。研究發現NET可顯著提腸道TNF-ɑ含量，進而使機體腫瘤細胞發生壞死，從而保護機體免受污染物侵襲。

環境中NET等孕激素物質進入斑馬魚，會對斑馬魚腸道組織產生一定影響，而斑馬魚腸道組織將以產生炎癥來抵御NET引起的損傷，并分泌免疫調節因子以激起機體的免疫應答，進而誘導免疫細胞對機體的炎癥進行修復。湛江近海沉積物中，多氯聯苯可誘導斑馬魚腸道IL-1β、IL-8和TNF-α基因的轉錄表達[20]；多溴聯苯醚（DE-71）可提高斑馬魚腸道中IL-1β水平[27]；聚苯乙烯微塑料也可提高斑馬魚腸道中IL-1α、IL-1β、IFN基因的轉錄表達水平和蛋白水平[28]。這些環境污染物對免疫調節因子的影響，可反映斑馬魚機體發生炎癥以及受損情況。因此，免疫調節因子的含量變化可以用于監測環境污染物的污染情況。

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Effects of Northindrone on Immunoregulatory Factors of Intestine in Zebrafish ()

LIANG Yan-qiu1, SITU Yan-jie1, DONG Zhong-dian2, XU Wen-qiang1, LIANG Xing-yi1, JING Zhan-xin1

（1.,,524088,; 2.,524088,）

To assess the adverse effects of the progestin northindrone on immunoregulatory factors of the intestine in zebrafish ().Adult zebrafish were exposed to 0, 7, 84 and 810 ng/L northindrone for 90 d, and the effects of northindrone on the contents of nuclear factor κB (NF-κB), as well as cytokines containing interferon α (IFN-α), interleukin 1α (IL-1α), interleukin 1β (IL-1β), and tumor necrosis factor α (TNF-α) were investigated in the intestine of females and males.Northindrone significantly increased the levels of IFN-α, IL-1α and TNF-α in the intestine of females, as well as NF-κB, IFN-α, IL-1α, IL-1β and TNF-α in the intestine of males.Northindrone could activate the NF-κB signaling pathway and promote the secretion of cytokines in the intestine of zebrafish, consequently induce inflammation response in the intestine.

; intestinal immunity; norethindrone; progestin; interruption; cytokines;nuclear factor-kappa B

X174；X503.225

A

1673-9159（2020）03-0001-06

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.03.001

2020-01-13

廣東省自然科學基金項目(2017A030310662)；國家自然科學基金項目(41907346)；廣東海洋大學科研啟動費資助項目(R17075)；廣東海洋大學2019年度大學生創新訓練項目（CXXL2019304）

梁燕秋（1989—），女，博士，講師，主要從事環境化學與生態毒理學研究。E-mail: liangyanqiu11@126.com

董忠典（1987—），男，博士，講師，主要從事水產動物健康養殖及分子生物學研究。E-mail: dzhd888@163.com

景占鑫（1986—），男，博士，講師，主要從事海洋化學方向的研究。E-mail：393345494@qq.com

梁燕秋，司徒艷結，董忠典，等. 炔諾酮對斑馬魚腸道免疫調節因子的干擾效應[J]. 廣東海洋大學學報，2020，40（3）：1-6.

（責任編輯：劉慶穎）