甲狀腺乳頭狀癌預后不良相關基因的生物信息學分析

高建 張國烈 林元美 章國亮 陳一鈞

【摘要】 目的 通過甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）生物信息學分析，獲取與PTC預后顯著相關的基因，為PTC的發病機制提供理論依據。方法 從NCBI的GEO Databases數據庫檢索PTC的芯片數據GSE3678、GSE33630和GSE82208，三組基因芯片共包含94例PTC及77例癌旁組織基因表達譜。使用GEO2R工具分析PTC與癌旁組織差異表達的基因;將共表達的基因導入可視化數據庫（the database for annotation，visualization and integrated discovery，DAVID）進行基因富集分析（gene ontology，GO）和信號通路分析（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）;使用STRING和Cytoscape進行蛋白質互作網絡分析（protein-protein interaction，PPI）;使用GEPIA分析核心基因的生存信息。隨后培養PTC細胞株，收集52例臨床組織樣本，分別驗證FN1在PTC組織樣本和細胞中的表達情況。結果 GSE3678、GSE33630和GSE82208共有152個共表達基因，其中24個上調表達，128個下調表達。這152個異常表達基因（different expression genes，DEGs）在PTC細胞組分、分子功能、生物學行為上主要集中于影響細胞正常分化及富集于甲狀腺激素合成信號通路等。PPI顯示，基因AGTR1、AVPR1A、EGR2、FGFR2、FN1、FOSB、GNA14、JUN、EDN、IRS1、SPP1相互之間緊密相關。進一步的生存分析顯示，AGTR1、AVPR1A、EGR2、FGFR2、FN1、FOSB、GNA14、JUN與無病生存時間相關，但總體生存時間無差異。FN1在31例（59.61%）PTC組織中呈上調表達，平均表達倍數變化為（3.75±5.90）倍。與Nthy-ori 3-1細胞相比，BCPAP和TPC-1中FN1的表達水平分別提高了（475±1.12）倍、（11.89±3.53）倍（P<0.01）。結論 AGTR1、AVPR1A、EGR2、FGFR2、FN1、FOSB、GNA14、JUN在PTC中異常表達且預示著較差的臨床預后;FN1基因在PTC組織和細胞株中表達增高。

【關鍵詞】 甲狀腺乳頭狀癌;生物信息學;異常表達基因;FN1;臨床預后

中圖分類號：R736.1 ? 文獻標志碼：A ? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.07.003

【Abstract】 Objective To obtain genes significantly associated with papillary thyroid carcinoma（PTC） by bioinformatics analysis of PTC，so as to provide theoretical basis for the pathogenesis of PTC.Methods The data of PTC chip （GSE3678，GSE33630 and GSE82208） were retrieved from the GEO databases of NCBI.The gene expression profiles of 94 PTCs and 77 paracancerous tissues were included in the three gene chips.GEO2R tool was used to analyze genes differentially expressed in PTC and adjacent tissues.The co-expressed genes were introduced into the visual database （the database for annotation，visualization and integrated discovery，DAVID） for gene enrichment analysis （gene ontology，GO） and signal pathway analysis（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）.The network analysis of protein-protein interaction（PPI） was performed by STRING and Cytoscape.GEPIA was used to analyze survival information of core genes.PTC cell lines were cultured and 52 clinical tissue samples were collected，and the expressions of FN1 in PTC tissue samples and cells were verified，respectively.Results There were 152 co-expressed genes in GSE3678，GSE33630 and GSE82208，of which 24 were up-regulated and 128 were down-regulated.In PTC cell components， molecular functions and biological behavior，these 152 abnormal expression genes（DEGs） mainly focused on affecting the normal differentiation of PTC cells and enriching in the signal pathway of thyroid hormone synthesis.PPI showed that AGTR1，AVPR1A，EGR2，FGFR2，FN1，FOSB，GNA14，JUN，EDN，IRS1 and SPP1 were closely related to each other.Further survival analysis showed that AGTR1，AVPR1A，EGR2，FGFR2，FN1，FOSB，GNA14 and JUN were related to disease-free survival time，but there was no difference in overall survival time.FN1 was up-regulated in PTC tissues of 31 cases （59.61%），and the average expression multiple was （3.75±5.90） times.Compared with Nthy-ori 3-1 cells，the expression levels of FN1 in BCPA and TPC-1 increased by（4.75±1.12） times and （11.89±3.53） times，respectively（P<0.01）.Conclusion AGTR1，AVPR1A，EGR2，FGFR2，FN1，FOSB，GNA14 and JUN are abnormally expressed in PTC and predicted poor clinical prognosis.And FN1 gene expression is increased in PTC tissues and cell lines.

【Key words】 PTC;bioinformatic;differentially expressed gene;FN1;clinical prognosis

甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）的患病率在全國范圍內每年以20%的速度增長，已成為第四位高發腫瘤[1～2]。大多數PTC分化類型良好，10年生存率超過90%，但由于不斷增加的確診案例，即使總體死亡率沒有變化，復發的案例逐年增多[3～5]。促甲狀腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）抑制治療、131I放射治療是PTC患者術后預防復發的重要手段。但即使經過規范化治療，仍有部分患者出現不明原因復發。PTC術后復發機制的不明確，影響著甲狀腺外科醫師對患者的術后個體化管理。生物信息學（bioinformatic）是一門交叉學科，它包含基礎生物學、信息科學及臨床醫學，有助于我們揭示腫瘤發生發展的病理機制等[6]。本研究的目的在于借助生物信息學的大數據，準確篩選出與PTC相關的基因表達情況，分析異常表達基因與PTC患者的臨床預后的相關性，為PTC的分子機制研究及臨床醫師術后個體化管理提供理論依據。

1 材料與方法1.1 基因芯片數據素材的檢索 基因表達譜芯片數據源于NCBI的GEO數據庫，檢索條件為“papillary thyroid carcinoma”或“papillary thyroid cancer”，將GSE3678、GSE33630和GSE 82208三組基因芯片表達譜芯片數據納入研究，三組基因芯片表達譜均基于GPL570平臺，共包含94例PTC和77例癌旁組織。

1.2 基因芯片表達數據的分析 基因芯片表達譜數據使用GEO Databases的在線工具GEO2R （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r）進行R語言處理，下載后的基因芯片表達譜數據的篩選標準為：與癌旁組織相比，差異表達倍數|logFC|>2，P<0.05。隨后使用Bioinformatics & Evolutionary Genomics 工具對篩選出的DEGs進行韋恩（Venn）分析，篩選出共表達基因。

1.3 GO、KEGG富集及PPI網絡分析 將上述共表達基因導入DAVID生物信息數據庫進行生物信息注釋、GO分析等，涵蓋生物學的細胞組分（BP）、分子功能（CC）、生物過程（MF）。KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）分析用于處理異常表達基因在生物信號通路方面的富集情況及程度（FDR<0.05）。PPI分析使用STRING工具，分析各蛋白質靶點之間的聯系。隨后使用Cytoscape的MCODE插件進行PPI網絡可視化，分析蛋白質之間的潛在關聯，并篩選出與PTC發展相關的關鍵基因。

1.4 與PTC相關關鍵基因的臨床預后分析 GEPIA數據庫整合了TCGA和GTEx，可滿足單基因或多基因與癌癥之間關聯的分析。我們使用GEPIA分析上述關鍵基因與THCA臨床預后之間的關系（P<0.05）。

1.5 FN1基因在PTC組織及細胞株中表達的驗證 選取2018年9月至2019年8月在莆田學院附屬醫院就診，病理診斷為PTC的組織樣本作為實驗材料，共52例PTC及配對癌旁組織在手術后被立刻收集并浸泡于RNA later中，儲存于-80℃冰箱備用。BCPAP和TPC-1兩株甲狀腺癌細胞株以及Nthy-ori 3-1正常甲狀腺細胞購自中國科學院上海細胞生物研究所，置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養中，在37℃，5% CO2的環境中培養。

1.6 總RNA的提取及qRT-PCR實驗 提取甲狀腺乳頭狀癌和配對組織以及甲狀腺癌細胞株的總RNA，隨后qRT-PCR反轉錄。內參基因參考國內外文獻，選擇18S作為內參序列為：上游5-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3，下游5-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3;FN1上游5-AGGCAAATCGCAAGAGGCAAGG-3，下游為：5-CACATCAGGCACAGCACTCCAG-3。FN1基因表達量的計算使用ΔCt表示，ΔCt =CtFN1-Ct18sRNA。

1.7 統計學方法 實驗數據的統計由SPSS 19.0和Graph Prism 5.0進行，FN1在甲狀腺癌組織和細胞株中的表達的比較用獨立樣本T-test，其表達量采用均數±標準差的形式表示，檢驗水準：α=0.05。

2 結 ?果2.1 PTC相關DEGs的篩選與認證 經篩選，GSE3678、GSE33630和GSE82208基因芯片符合入組。GEO2R分析顯示，共94例PTC和77例癌旁組織納入研究，分別篩選出1141個、2100個和860個DEGs。Venn分析顯示，三組基因芯片中152個基因為共表達基因，其中24個為上調表達，128個為下調表達基因。見表1及圖1、圖2。

2.2 GO、KEGG分析顯示DEGs與甲狀腺細胞的基礎代謝相關 上述152個共表達基因的GO分析顯示，生物進程（BP）方面：DEGs富集于細胞代謝、上皮細胞遷移的正向調節、軸突延伸的正調控、轉化生長因子-β受體信號通路及SMAD蛋白信號轉導等;細胞組分（CC）分析顯示，DEGs集中在基底外側質膜和鳥苷酸交換因子復合物等;分子生物功能（MF）顯示，DEGs有氧化還原酶活性，主要作用于供硫基團，與信號素受體結合等;KEGG分析表明，DEGs是甲狀腺激素合成途徑中的優勢基因，甲狀腺激素合成途徑是甲狀腺激素、甲狀腺球蛋白和甲狀腺過氧化物酶的核心調節。見表2，圖3。

2.3 PPI蛋白質互作網絡分析 PPI蛋白網絡分析了152個DEGs，其中86個下調表達和11個上調表達基因在PPI蛋白網絡中相關，共有145個蛋白作用節點，156種作用聯系。Cytoscape中的MCODE插件分析顯示，其中11個基因存在密切關聯，分別是：AGTR1、AVPR1A、EGR2、FGFR2、FN1、FOSB、GNA14、JUN、EDN3、IRS1、SPP1，FN1是其中的核心基因。見圖4。

2.4 與PTC緊密相關基因的臨床預后分析 用GEPIA對上述11個基因的臨床預后進行預測，發現這些基因的總體生存率（overall survival，OS）差異無統計學意義（P>0.05），但其中8個基因的無病生存率（disease-free survival，DFS）明顯縮短，分別為AGTR1（HR=0.36，P<0.001），AVPR1A（HR=0.47，P=0.013），EGR2（HR=0.38，P=0.002），FGFR2（HR=0.52，P=0.029），FN1（HR=2.0，P=0.024），FOSB（HR=0.51，P=0.023），GNA14（HR=0.45，P=0.011），JUN（HR=0.43，P=0.006）。見圖5。

2.5 FN1在PTC組織和細胞株中表達增高 共有52例臨床樣本納入研究，FN1在31例（59.61%）PTC組織中呈上調表達，平均表達倍數變化為（3.75±5.90）倍。見圖6A、圖6C。與Nthy-ori 3-1細胞相比，BCPAP和TPC-1中FN1的表達水平分別提高了（4.75±1.12）倍、（11.89±3.53）倍（均P<0.01）。見圖6B。表明FN1在PTC組織和細胞中的表達增加，可能與PTC病情進展相關。

3 討 ?論 ?PTC雖然是最常見的惡性腫瘤之一，卻并非是研究得最徹底或最完整的，其發病機制仍然無法完整闡述[7～8]。生物信息技術是一門先進的交叉學科，能將微觀視界，比如基因表達差異、蛋白之間的作用等宏觀化，有利于我們了解PTC的發病機制[9～10]。因此，從生物信息方面對PTC做進一步研究，不僅有助于我們了解發病機制，還能幫助我們臨床決策。

本研究中，通過基因數據庫檢索了GSE3678、GSE33630和GSE82208三個基因表達譜芯片，篩選出24個上調表達以及128個下調表達的基因。對152個DEGs的基因富集分析、功能分析發現，這些差異表達的基因對細胞代謝、上皮細胞遷移的正向調節、軸突延伸的正調控、轉化生長因子-β受體信號通路、SMAD蛋白信號轉導有關，而這些影響都能促進癌細胞的增殖或遷移。而對DEGs的傳導信號通路的分析發現，這些異常表達的基因主要富集在甲狀腺激素合成的信號通路，該信號通路主要調節甲狀腺激素、甲狀腺球蛋白、甲狀腺過氧化物酶等的分泌，與調節甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖、轉移有顯著相關。腫瘤細胞產生作用的一個關鍵因素是影響蛋白質的表達，異常表達的基因通常影響蛋白質的結構和功能，從而影響細胞的代謝。因此我們對DEGs做了進一步的PPI分析，結果顯示這些基因所表達的蛋白之間作用復雜，共有145個蛋白作用節點，156種作用聯系。MCODE分析PPI蛋白網絡中相互作用的強關聯區域，這對蛋白網絡中分子復合體預測很重要。通過MCODE我們發現AGTR1、AVPR1A、EGR2、FGFR2、FN1、FOSB、GNA14、JUN、EDN3、IRS1和SPP1存在強關聯，生存預測發現，其中AGTR1、AVPR1A、EGR2、FGFR2、FN1、FOSB、GNA14、JUN與DFS顯著相關，OS方面未受影響。根據蛋白質網絡分析，我們初步確定FN1為上調表達的核心基因，隨后我們進一步在PTC組織樣本和細胞株中分析FN1的表達，發現FN1在PTC組織樣本和細胞株中都高表達。

查閱相關文獻發現，血管緊張素Ⅱ受體1（angiotensin-2 type 1 receptor，AGTR1）在肝癌細胞內低表達，過表達AGTR1能促進肝癌細胞的增殖、轉移，抑制AGTR1的表達，能抑制肝癌細胞的增殖、遷移[11～12]。精氨酸血管加壓素受體1α（arginine vasopressin receptor 1α，AVPR1A）也是一種下調表達的基因，AVPR1A有助于激活參與前列腺癌中去勢抵抗性產生的信號通路，從而影響其預后，而去勢抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer，CRPC）是一種致命性的晚期前列腺癌形式[13]。早期生長反應因子2（the early growth responsive-2，EGR2）在肝細胞癌中低表達，是一種反式作用蛋白，參與腫瘤抑制基因PTEN介導的細胞凋亡途徑，調控細胞增殖和凋亡[14～15]。纖維細胞生長因子受體2（basic fibroblast growth factor receptor-2，FGFR-2）在胃癌組織中的表達結果顯示，在淋巴結轉移組表達高于無轉移組，浸潤程度越深表達越高，胃癌癌周微淋巴管密度高于正常胃組織，FGFR-2可通過促進淋巴管生成參與胃癌浸潤轉移[16～18]。與胃正常組織相比，纖維連接蛋白1（fibronectin-1，FN1）在胃癌組織中表達增加，其表達量與胃癌患者總體生存率存在相關性，即高表達FN1的患者總體生存率較差[19～20]。甲狀腺乳頭狀癌轉移的淋巴結組織中FN1表達顯著增高，且其表達隨病理分級增加表達升高。高表達FN1的患者無復發生存期顯著短于低表達患者，可以作為預測淋巴結轉移和判斷預后的重要因子[21]。

甲狀腺的功能單位是濾泡，由單層甲狀腺細胞分隔，濾泡的基底和頂端表面分別面向血流和內腔，本文研究發現DEGs富集在頂膜，DEGs可能影響頂膜及甲狀腺激素的代謝。甲狀腺細胞合成、儲存并分泌甲狀腺球蛋白（TG），碘化的TG通過頂膜再吸收并在溶酶體中降解形成T3/T4，然后T3/T4通過基底膜分泌[22～23]。TG是分化型甲狀腺乳頭狀癌（DTC）的腫瘤標志物，可作為分化型甲狀腺乳頭狀癌患者治療后隨訪的重要參考指標[24]。因此DEGs可能通過影響甲狀腺激素合成信號通路的表達，而對甲狀腺乳頭狀癌的病情進展產生影響。

PTC分化類型良好，術后5年生存率可達97.9%，然而在這類良好分化的腫瘤當中仍有部分患者預后差、無病生存時間短[25～26]。鑒于PTC發病率和復發病例不斷上升，尋找一種可靠的復發風險評估方法甄別高危人群指導臨床決策顯得極為重要[27]。我們PPI蛋白網絡分析顯示11個核心基因與PTC相關，進一步分析顯示，這11個核心中有8個與DFS有顯著相關，說明在不影響總體生存的情況下，存在這8個異常表達基因的患者，術后復發的風險顯著增高，這有助于我們進行個體化案例術后隨訪。

本文通過生物信息學方法分析PTC及癌旁組織的基因表達譜芯片數據，發現影響PTC發生、發展的重要通路及關鍵基因，為闡述PTC的發病機制及診斷提供了全新視角，并為PTC靶向抑制劑的開發提供新的方向。根據大數據預測的PTC相關信號通路及關鍵基因為FN1，也初步驗證了FN1在PTC組織樣本和細胞株中都是高表達的，但在PTC病程進展中的作用還有待進一步研究。

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（收稿日期：2020-03-12 修回日期：2020-04-22）

（編輯：潘明志）