蘇云金芽孢桿菌菌劑培養條件的優化及毒力測定

李洋 公旭彤 劉想 王加男 秦秀麗

【摘? ?要】 通過單因素及正交試驗對蘇云金芽孢桿菌菌劑的培養條件進行了優化。結果表明最適宜培養基配方為馬鈴薯粉20g/L，蛋白胨20g/L，KH2PO42g/L，MgSO42g/L，pH8.0;最適培養條件為溫度35℃，培養時間48h。

【關鍵詞】 蘇云金芽孢桿菌;菌劑;培養基;毒力測定

中圖分類號：S312? ? ? ? ? ? ? ?文獻識別碼：A? ? ? ? ? ? ? ?文章編號：2096-1073（2020）09-0052-53

Optimization of Culture Conditions and Determination of Virulence of Bacillus Thuringiensis

LI Yang， GONG Xutong， LIU Xiang， WANG Jianan， QIN Xiuli*

（Jilin Agricultural Science and Technology University? ?Jilin， Jilin? ?132101）

[Abstract] The culture conditions of Bacillus thuringiensis agent were optimized by single factor and orthogonal experiments. The results showed that the optimal medium formula was potato powder 20g/L， peptone 20g/L， KH2PO42g/L， MgSO42g/L， pH8.0. The optimum culture conditions were 35℃ and 48h.

[Key words] bacillus thuringiensis; bactericide; culture medium; virulence determination

在農作物生產中，經常會發生蟲害，與化學農藥相比，微生物殺蟲劑已成為全球農藥產業發展的重點[1-2]。其中蘇云金芽孢桿菌為革蘭氏陽性菌，其生長繁殖快，具有較強的適應性，易于人工培養，對直翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目、鱗翅目等多種農業害蟲有很強毒殺作用，是目前世界上應用最廣的細菌性殺蟲劑。本試驗對蘇云金芽孢桿菌產芽孢的培養配方和培養條件進行優化，旨在為蘇云金芽孢桿菌菌劑的生產提供理論依據。

1? 材料和方法

1.1? 試驗材料

蘇云金芽孢桿菌WY-197菌株，為吉林農業科技學院生物與制藥工程學院微生物實驗室保藏菌種;牛肉膏蛋白胨斜面試管培養基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，瓊脂 20g/L，分裝試管，常規滅菌后備用;液體菌種培養基：不加瓊脂，裝入250mL三角瓶中，每瓶裝入量100mL，常規滅菌后備用;碳源基礎培養基：蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L;氮源基礎培養基：葡萄糖10g/L，NaCl 5g/L;無機鹽基礎培養基：葡萄糖10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L。以上培養基調pH值為7.4-7.6。

1.2? 培養條件的優化

培養溫度設25、30、35、37、40℃ 五個水平，培養72h;培養時間設24h、36h、48h、60h、72h 五個水平;培養基初始pH值設6.5、7.0、7.5、8.0、8.5五個水平。對芽孢進行染色顯微觀察，對菌劑進行毒力測定，考查芽孢釋放的最適培養溫度、時間、pH值。

1.3? 培養基質及配方的優化

碳源、氮源、無機鹽的單因素比較：在供試碳源基礎培養基中，分別加入葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、馬鈴薯粉、玉米淀粉各10g/L;在供試氮源基礎培養基中，分別加入酵母膏、蛋白胨、大豆（煮熟粉碎）、魚粉（粉碎）、麥麩（粉碎）各10g/L;在供試無機鹽基礎培養基中，分別添加FeSO4、KH2PO4、MgSO4各4g/L，以及FeSO42g/L+KH2PO42g/L、FeSO42g/L+MgSO42g/L、KH2PO42g/L+MgSO42g/L。

培養基質適宜配方綜合比較：在碳源、氮源、無機鹽單因素試驗結果，設計L9（34）正交試驗（見表1），配制9種培養基以得出最適培養基配方。

1.4? 毒力測定[3]

從淘寶平臺購得黃粉蟲活體鮮活種蟲以及飼料，用規格為長18cm×寬13cm×高6cm塑料盒為裝蟲容器，每個塑料盒內放50g飼料，噴施10mL的菌液，使菌液與飼料充分拌勻，然后放入20只幼蟲，塑料盒上用紗布覆蓋，在溫度是20℃～25℃，暗光下飼養，同時以無菌水處理設空白對照，計算72h內幼蟲死亡率，根據幼蟲死亡率確定最適培養基配方和培養條件。

2? 結果與分析

2.1? 培養條件對菌劑毒力的影響

不同培養溫度、培養時間及不同pH對菌劑毒力的影響結果分別見圖1、圖2、圖3。圖1結果表明：當培養溫度為30℃時，喂飼昆蟲的死亡為85%;當培養溫度為35℃時，喂飼昆蟲的死亡率最高達到91%;當培養溫度為37℃時，喂飼昆蟲的死亡為32%，當培養溫度升高到40℃，幾乎觀察不到芽孢。說明當溫度超過35℃后不利于芽孢的形成，當溫度達到40℃時，不能形成芽孢;圖2結果表明：隨著培養時間的延長，涂片觀察芽孢數量逐漸增多，喂飼昆蟲的死亡率也在增加，菌劑培養48h時，喂飼昆蟲的死亡率達到最高，培養時間60h以后，菌劑中芽孢的數量幾乎沒有增加，喂飼昆蟲的死亡率沒有升高;圖3結果表明：隨著菌劑中pH值升高，噴施飼料喂飼昆蟲其死亡率逐漸升高，但在中性及偏酸性條件下，昆蟲死亡率升高不明顯，當pH值超過7.0時昆蟲死亡率升高較快，當pH值為8.0 時昆蟲死亡率最高，當pH值達到8.5時，昆蟲的死亡率有所下降。

2.2? 碳源、氮源、無機鹽優化試驗結果

對不同碳源、氮源、無機鹽的菌液進行毒力測定的試驗結果分別見圖4、圖5、圖6。圖4結果表明：以馬鈴薯粉和葡萄糖為碳源的菌劑，噴施后昆蟲死亡率最高，隨后依次是蔗糖>麥芽糖>玉米淀粉，由于馬鈴薯粉原料易得，比較適合于生產中選用;圖5結果表明：以蛋白質胨為氮源的菌劑噴施飼料喂飼昆蟲，昆蟲死亡率最高，表明菌劑中芽孢的數量最多，其次為是酵母膏，隨后依次為大豆>魚粉>麥麩;圖6結果表明：培養基質中含有KH2PO42g/L+MgSO42g/L兩種無機鹽的菌劑噴施飼料喂飼昆蟲時，菌劑中芽孢的數量最多，昆蟲死亡率最高，含有其他無機鹽的菌劑昆蟲的死亡率次序為KH2PO4+MgSO4>FeSO4+KH2PO4>FeSO4+MgSO4>KH2PO4>MgSO4>FeSO4。

2.3? 芽孢形成最適培養基配方的優化試驗結果

正交試驗設計見表1，試驗結果見表2，從表2可知：菌劑培養基配方的最佳組合為A3B3C2D2，即馬鈴薯粉20g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO42g/L，MgSO42g/L。從極差R可知，培養基中各組分對芽孢形成及菌劑毒力影響的排序為蛋白胨>馬鈴薯粉>MgSO4 >K2HPO4。

3? 結果與討論

本試驗結果表明，蘇云金芽孢桿菌WY-197菌株產芽孢適宜培養基的配方：馬鈴薯粉20g/L，蛋白胨20g/L，KH2PO42g/L，MgSO42g/L，pH8.0;最適培養溫度為35℃，培養時間為48h，在此條件下進行培養，菌劑產芽孢數量最多，毒力最強。微生物菌劑從實驗室走向應用是一個復雜的過程，本試驗所測得的菌劑毒力，是在實驗室條件下所測得的，在農業生產中菌劑施用后，對菌劑毒力的影響因素更為復雜，還需要進行深入的研究和探索。

參考文獻：

[1] 肖筠，黃世群，丁佶，等.微生物殺蟲劑——蘇云金桿菌（ Bt）[J].?四川農業科技，2008（4）： 44-45.

[2] 唐韻.我國生物農藥發展現狀與選用指南[J]. 農藥市場信息，2014（6）：52-57.

[3] 張瑋瑋，李紅梅，弓愛君，等.Bt生物農藥毒力效價檢測方法綜述[J].化學與生物工程，2009，26（11）：12-15.

[4] 楊航聰，金松松.蘇云金芽孢桿菌MS7培養條件的優化[N].杭州師范大學學報（自然科學版），2013，12（6）：535-538.

[5] 郭慧慧.試驗設計在蘇云金芽孢桿菌培養基優化中的應用[J].?閩東農業科技，2016（01）：19-23.

（編輯：李丹）