HPLC法同時測定赤水曬醋中9種有機酸

盧葉 張季 向麗萍 王蘭蘭 駱書娜 王奧

摘 要：本研究以赤水曬醋作為供試品，建立了一種以HPLC法檢測赤水曬醋中9種有機酸的分析方法。采用Waters XSelect HSS T3色譜柱，以20 mmol·L-1 NaH2PO4溶液為流動相，流速0.7 mL·min-1，柱溫25 ℃，檢測波長為215 nm，外標法定量。結果表明，赤水曬醋樣品中9種有機酸在線性范圍內均能達到很好的分離，相關系數≥0.999，建立的赤水曬醋有機酸的檢測方法靈敏、準確，重復性好。

關鍵詞：赤水曬醋;有機酸;高效液相色譜法

Abstract：In this study， Chishui sun vinegar was used as the test sample， 9 organic acids in Chishui sun vinegar was established by HPLC. In HPLC method， organic acids was separated on a Waters XSelect HSS T3 chromatographic column with 20 mmol·L-1 NaH2PO4 solution as the mobile phase with flow rate of 0.7 mL·min-1， column temperature was maintained at 25 ℃ and the wave length was detected at 215 nm.External standard method for quantification. The results of HPLC showed that 9 organic acids displayed good linearity. The correlation coefficients （R2） of 9 organic acids were more than 0.999， the established detection method for organic acid in Chishui sun vinegar is sensitive， accurate and reproducible.

Key words：Chishui sun vinegar; Organic acids; HPLC

中圖分類號：O657.72

赤水曬醋，即在貴州赤水以傳統的工藝生產，采用固體發酵繁殖產生天然醋酸菌，醋坯和成品醋均經日光曝曬，故稱“曬醋”，2015年曾獲“國家地理標志保護產品”[1]。目前針對貴州特色食品赤水曬醋僅有關于香氣成分[2]以及菌株和微生物[3-4]的分析研究，鮮有對其中有機酸類物質的研究報道。醋中含有豐富的有機酸，分為揮發酸和不揮發酸，其含量決定了醋滋味的柔和程度，揮發酸含量高的刺激性強，不揮發酸含量高的食醋刺激性小，酸味柔和[5]。有機酸類成分是赤水曬醋聞之酸香撲鼻、沁人肺腑，食之酸甜可口，濃香味美，回味綿長的特別滋味的主要來源，故有必要對曬醋中有機酸類成分進行檢測。文獻報道有機酸類成分的檢測多使用高效液相色譜法[6-9]、分光光度法[10]、離子色譜法[11]等。因此本研究以赤水曬醋為對象，建立并且優化了一種HPLC對其中的有機酸類成分同時測定的方法，為赤水曬醋進一步的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

標準物質：琥珀酸、蘋果酸、酒石酸、醋酸、草酸、乳酸、焦谷氨酸，均購自Dr Ehrenstorfer GmbH公司;檸檬酸，購自美國Sigma-Aldricb公司;丙酮酸，購自上海安譜實驗科技股份有限公司，純度≥98%。曬醋樣品，均為各大超市采購，見表1;磷酸二氫鈉、磷酸，均為分析純，購自天津科密歐化學試劑有限公司;實驗用水為Milli-Q超純水;0.22 μm尼龍有機濾膜，購自天津市津騰試驗設備有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent1260高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）、Milli-Q Reference超純水發生器（美國Millipore公司）、AL204-IC萬分之一天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

分別稱取各標準品適量，用水溶解定容配制標準儲備液，其濃度分別為0.821 2 mg·mL-1（草酸）、2.006 0 mg·mL-1（酒石酸）、0.869 2 mg·mL-1（丙酮酸）、2.002 8 mg·mL-1（蘋果酸）、2.000 0 mg·mL-1（乳酸）、2.066 4 mg·mL-1（乙酸）、2.207 6 mg·mL-1（檸檬酸）、2.000 0 mg·mL-1（焦谷氨酸）、4.007 2 mg·mL-1（琥珀酸）。于4 ℃冰箱中保存，使用時根據需要用流動相逐級稀釋成適當濃度的標準混合工作溶液。

1.3.2 供試品溶液制備

移取混合均勻后的曬醋樣品5 mL于50 mL容量瓶中，用去離子水定容，充分顛倒混勻，用0.22 μm的濾膜過濾棄初濾液，取續濾液供HPLC分析用。

1.3.3 檢測條件

Agilent 1260高效液相色譜儀，流動相：20 mmol·L-1 NaH2PO4溶液（用0.1%磷酸調pH，使pH=2.7）;流速：0.7 mL·min-1;進樣體積：10 μL;柱溫：30℃;紫外檢測器波長：215 nm;色譜柱：Waters XSelect HSS T3（5 μm，4.6 mm×250 mm）;等度洗脫（0～25 min）。

2 結果與分析

2.1 提取條件的優化

2.1.1 流動相pH值考察

為使有機酸盡可能以分子形式存在，一般使用酸性流動相來抑制有機酸的解離[12]。高海燕等[13]在以磷酸氫二鉀為緩沖鹽，實現了11種有機酸（純草酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、莽草酸、抗壞血酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸和琥珀酸）的良好分離，饒靜等[14]以磷酸氫二銨作為流動相檢測蘋果醋中有機酸。本試驗參考上述文獻的條件，比較了K2HPO4、（NH4）2HPO4以及NaH2PO4對有機酸分離效果的影響。首先用20 mmol·L-1的K2HPO4溶液調pH值來考察，當pH值為2.30時，酒石酸和丙酮酸的分離度不夠理想;當pH值為2.90時，乙酸和檸檬酸不能完全分開;當pH值為2.70時，酒石酸、丙酮酸有了很好的分離度，乙酸與檸檬酸分離度有了一定的改善。因此選擇pH為2.70作為最適實驗條件。鑒于乙酸與檸檬酸的分離度并未完全分離開，實際又進一步用20 mmol·L-1的NaH2PO4溶液和20 mmol·L-1的（NH4）2HPO4溶液調pH為2.70進行考察，發現當用20 mmol·L-1的NaH2PO4溶液調pH時，乙酸和檸檬酸以及酒石酸、丙酮酸均能得到很好的分離。

2.1.2 樣品前處理條件考察

本研究考察了樣品前處理稀釋2、5、10、50倍來進行提取，結果顯示樣品稀釋2倍和5倍時部分有機酸峰不能分開，當樣品稀釋50倍部分峰低于檢測限，所以選擇將樣品稀釋10倍進行處理。

2.1.3 色譜條件考察

試驗分別將0.5、0.7、0.8、0.9 mL·min-1的測定流速進行了對比，結果發現只有在0.7 mL·min-1的流速下峰型未見拖尾現象，并且能達到很好的分離度。

同時還對Waters XSelect HSS T3（5 μm，4.6×250 mm）色譜柱、Inertsil RODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱以及Agela Technologies Odyssil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱進行了摸索，發現Waters XSelect HSS T3（5 μm，4.6×250 mm）色譜柱對有機酸的分離有更好的效果。

2.2 系統適用性試驗

對9種有機酸在215 nm光譜下進行檢測，標準品與供試品均在此波長下有較強的吸收，標準品、樣品以及空白溶液的色譜圖見圖1所示。

2.3 方法學驗證

2.3.1 檢出限、定量限和線性方程

分別精密吸取各標準溶液以表2中的線性范圍，按1.3.3色譜條件進行檢測，精密量取已知濃度的各標準溶液以表2中的線性范圍依次稀釋制成系列濃度由高到低的溶液，進樣10 μL，測得各有機酸的檢測限（Limit of detection，LOD，S/N=3）和定量限（Limit of quantitation，LQD，S/N=10）分別以對照品的濃度（X）為橫坐標，峰面積積分值（Y）為縱坐標，得到回歸方程，9種有機酸在表2所示的線性范圍內均有良好的線性關系，其相關系數R2均大于0.999。

2.3.2 精密度、穩定性和重復性試驗

取高、中、低3種濃度的有機酸對照品溶液，在1.3.3色譜條件下連續進樣6次，記錄9種有機酸的色譜峰峰面積并計算峰面積的RSD<3%，表明日內精密度良好。連續3天測試，計算峰面積的RSD<3%，表明日間精密度良好。

取同一個曬醋樣品6份，精密稱定，按“供試品溶液制備”項下操作，在1.3.3色譜條件下進樣測定，計算每個有機酸色譜峰的峰面積及其相對標準偏差 RSD，結果如表3所示，表明方法重復性良好。

取曬醋樣品約5 mL，精密稱定，按“供試品溶液制備”項下操作，在1.3.3色譜條件下，分別于0、2、4、8、12、24、48 h和72 h測定，記錄9種有機酸的色譜峰的峰面積，RSD良好均符合要求，結果表明供試品溶液在72 h內穩定性良好。

2.3.3 加標回收率試驗

取已知含量的曬醋樣品，精密稱定，分別加入一定含量的對照品，按“供試品溶液制備”項下操作，在1.3.3色譜條件下進樣測定并計算加樣回收率，平均加標回收率如表4所示。

2.4 曬醋樣品測定

分別取市場收集的曬醋樣品約5 mL，精密稱定，按“供試品溶液制備”項下操作，制成供試品溶液。分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀進行測定，計算9種有機酸在曬醋中的含量，結果見表5。

3 討論

本研究通過對供試品溶液的前處理條件和色譜條件進行優化，建立了一種能夠同時測定赤水曬醋中9種有機酸的高效液相色譜方法。結果顯示該方法有很好的線性范圍、精密度、重復性、穩定性、加標回收率，該方法可有效去除雜質干擾，且具有快速、便捷、準確性高等優點，可用于曬醋類產品中有機酸的準確測定。

采用本文所建立的方法對赤水曬醋樣品有機酸進行的含量分析可以看出，除了乙酸揮發酸以外，不揮發酸琥珀酸和乳酸的含量最高，其中琥珀酸為酵母菌發酵的代謝產物，具有鮮酸爽口的滋味[15]。乳酸存在能夠緩和發酵食醋中乙酸帶來的強烈刺激性，從而賦予食醋酸味柔和的特點，赤水曬醋中不揮發酸的總含量要高于揮發酸的總含量，這與其酸味柔和的滋味特點相符，也對赤水曬醋滋味的進一步研究提供參考。

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基金項目：貴州省質量技術監督局科技計劃項目“貴州地理標志產品赤水曬醋品質特征研究”（編號：2017kj010）;遵義市優秀青年科技創新人才培養項目“貴州省特色食品質量與安全研究及應用”（編號：遵優青科[2018]

4號）;貴州省科技計劃課題“貴州匯川城郊現代農業科技示范園區”（編號：黔科合平臺人才[2016]5243-02號）。

作者簡介：盧 葉（1991—），女，碩士;研究方向為食品檢測技術。

通信作者：王 奧（1986—），男，博士，高級工程師;研究方向為食品質量與安全風險。