使用全自動酶免工作站進行酶聯免疫吸附試驗的效果評估

張鵬 魏巍 李玉燕 王懷娜 包丹丹 趙清華 丁愛君 郭龍宗

摘? 要：利用Freedom EVO 150全自動酶免工作站結合商品化ELISA試劑盒，建立檢測動物血清樣本的自動化高通量酶免檢測方法，評估其可靠性和穩定性，并探討其在獸醫衛生領域的應用前景。選取高、中、低抗體滴度的三組血清樣本、商品化的標準品血清及實驗室自制的質控品血清，在相同的實驗條件下使用全自動酶免工作站和純手工操作同時進行四個項目的檢測。通過兩種檢測方法結果對比，可發現二者的結果具有平行性和一致性，且各質控品的檢測結果都在正常范圍內。本文初步建立了四個項目的自動化檢測方法，并將其應用于日常大批量檢測，從而大大提高工作效率和降低實驗員的勞動強度。

關鍵詞：自動化;Freedom EVO;酶免工作站;酶聯免疫吸附試驗

中圖分類號：S851.4+1? ? ?文獻標識碼：B? ? ?文章編號：1673-1085（2020）7-0010-05

當今科技飛速發展的時代，自動化檢測技術正逐步進入獸醫衛生領域，建立自動化、標準化的動物疫病檢測實驗室體系已是一種趨勢。全自動酶免工作站通常有移液機械臂、移板機械臂、孵育模塊、洗板模塊、讀數模塊、控制電腦和軟件等組成，它可根據客戶的具體實驗需求進行編程，自動化的完成酶免實驗的加樣、孵育、洗板、讀數等實驗過程，配合商品化ELISA試劑盒可建立一整套完成的檢測體系。2019年底，本單位購置Freedom EVO 150全自動酶免工作站一套，結合商品化ELISA試劑盒和手工檢測，對其可靠性和穩定性進行了評估。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 樣本血清? 350份雞血清樣本采集自膠東半島某養殖場，分別對禽肺病毒（APV）、禽傳染性支氣管炎（IB）、禽敗血支原體（MG）、禽滑液支原體（MS）四個項目進行手工檢測，每個項目選取高、中、低抗體滴度，各29份血清。

1.1.2? 標準品與質控品? 血清標準品購自荷蘭BioChek公司（批號：FR16）;自制質控品選取中等抗體的雞血清混合后離心分裝制成，其抗體的效價經多次檢測已有參考范圍。

1.1.3? 主要試劑? 禽敗血支原體ELISA抗體檢測試劑盒（荷蘭BioChek公司，批號：FS7650）;禽滑液支原體ELISA抗體檢測試劑盒（荷蘭BioChek公司，批號：FS7713）;禽傳染性支氣管炎ELISA抗體檢測試劑盒（荷蘭BioChek公司，批號：FS7510）;禽肺病毒ELISA抗體檢測試劑盒（美國IDEXX公司，批號：S101）。

1.1.4? 主要儀器? Freedom EVO 150全自動酶免工作站（瑞士Tecan公司）;Wellwash 洗板機（美國ThermoFisher公司）;MK3酶標儀（美國ThermoFisher公司）。

1.1.5? Freedom EVO 150 全自動酶免工作站主要參數和布局圖? 主機平臺（含擴展臺）長195cm，深78cm，高120cm;臺面具有45個軌道，最多可平鋪放置28塊標準孔板，具有96通道移液機械臂和移板機械臂，雙機械臂相互獨立可平行工作;密閉式溫控孵育模塊位于臺面后方，可放置12塊板，溫控范圍：室溫在5～53℃;儲板架位于臺面后方，可放置24塊板;洗板模塊位于右側擴展臺的上方，具有96通道洗板頭;讀數模塊位于右側擴展臺的下方，具有12個測量通道，波長范圍為：400～700nm，1nm步進;裝有控制軟件的控制電腦。臺面布局見圖1。

1.2? 方法

1.2.1? 試劑和樣本準備? 實驗開始前，所有試劑及被檢血清樣本恢復至18～26℃，試劑和被檢血清樣本應輕輕地旋轉或震蕩予以混勻。預先將自制質控品和被檢血清樣本標記好孔位置轉移到96孔稀釋板中。將濃縮洗板液配置成工作濃度的洗板液。

1.2.2? 待測樣本的稀釋? 將自制質控品和被檢血清樣本進行500倍稀釋。向稀釋板中加入190μL和240μL樣本稀釋液，分別取10μL標記好孔位置的自制質控品和被檢樣本加入到已經準備好的190μL樣本稀釋液中，充分混勻;再取10μL混合后的樣本加入到已經準備好的240μL樣本稀釋液里混勻，完成對自制質控品和被檢樣本的500倍稀釋。稀釋步驟分別用全自動酶免工作站完成和實驗員手工操作完成。

1.2.3? 酶聯免疫吸附試驗? 手工操作參考四個項目試劑盒中的操作說明書進行。自動化操作先由工作站廠家工程師參考相應的試劑盒說明書進行編程，實驗員按照提示運行相應的程序直至檢測完成。

2? 結果

2.1? 一致性測試結果? 測試結果見圖2～圖5。

從圖2～圖5可見，自動化操作和手工操作的結果具有平行性和一致性。

2.2? 穩定性測試結果

2.2.1? 陰陽對照計算公式：陰性對照平均值（NC X）=（NC1+NC2）/2;陽性對照平均值（PC X）=（PC1+PC2）/2。

2.2.2? 標準品和自制內控品結果計算公式：標品或內控品S/P值=（標品或內控品OD值-NC X）/（PC X-NC X）;禽肺病毒（APV）Log10滴度=1.09×（Log10 S/P）+3.36;禽傳染性支氣管（IB）Log10滴度=1.0×（Log10 S/P）+3.62;禽敗血支原（MG）Log10滴度=1.1×（Log10 S/P）+3.156;禽滑液支原體（MS）Log10滴度=1.27×（Log10 S/P）+3.156。

2.2.3? 測試結果：根據上述公式可計算出標準品和自制內控品的滴度，其測試結果分別見表1～表4。

由表1～表4可發現，各項目標準品和自制質控品的檢測滴度均在參考范圍內。

3? 討論

1971年，瑞典斯德哥爾摩大學Peter Perlmann和 Eva Engvall、荷蘭歐伽儂公司的Anton Schuurs和Bauke van Weemen以及法國巴斯德研究所的Stratis Avrameas等人分別獨立地發表了辣根過氧化物酶HRP標記的應用文章，建立了酶聯免疫分析方法[1]。20世紀80年代，基于臨床免疫分析的市場需求以及電機和微處理器技術的發展，第一臺真正的自動化移液工作站得以被開發[2]。20世紀90年代，作為自動化移液工作站開發最早和應用最廣泛的領域，具有廣闊前景和巨大用戶體量的自動化酶免市場不斷刺激多個廠家投入其中，并不斷開發出一代代的自動化酶免分析系統，從最初的單通道、雙通道移液到后來的8通道和96通道移液。我國引入自動化酶免工作站的歷史可以追溯到上世紀90年代末期。本世紀的最初十年，隨著醫院和血站的酶免檢測如火如荼的開展[3，4]，全自動酶免工作站的應用也達到頂峰。近年來，隨著自動化檢測技術逐步進入獸醫衛生領域，全自動酶免工作站也開始被廣大動物疫病實驗室的工作人員熟知和使用。

本研究選取禽肺病毒（APV）、禽傳染性支氣管炎（IB）、禽敗血支原體（MG）、禽滑液支原體（MS）四個項目的商品化ELISA檢測試劑盒對待檢血清樣本、自制內控品、標準品分別使用全自動酶免工作站和手工檢測進行平行性測試和穩定性分析，可以得出自動化檢測具有可靠性和穩定性的結論。基于此結論，本實驗室建立多個項目的自動化檢測方法，并應用于日常大批量檢測。

全自動酶免工作站是由機械臂、孵育模塊、洗板模塊、讀數模塊等部分組成的大型綜合設備，它可以全自動完成酶聯免疫吸附實驗的整個過程，包括稀釋、加樣、孵育、洗板、讀數、結果判讀等過程[5]。全自動酶免工作站可以根據用戶的實驗需求進行配置，從而分別滿足高通量和靈活性的要求，亦可兼顧。全自動酶免工作站提高工作效率的核心在于多任務平行進行的工作模式，簡單地說就是利用第一塊板的孵育時間，進行后續板子的加樣進板。由于孵育時間是有限的，所以加樣速度就決定了后續的進板數量，也就決定了整個流程的批處理量。另外，由于每塊板孵育完成后都需要進行洗板，洗板也成為重要的限速步驟。基于這兩點，我們選擇配置96通道移液機械臂進行稀釋、加樣和加試劑，配置96通道高速洗板機進行洗板，以適合大批量集中檢測。孵育作為酶免試驗耗時最多的步驟也是非常重要的，為了避免邊緣效應、避光和防蒸發，建議使用密閉式孵育塔。需要注意的是，使用全自動酶免工作站進行大批量檢測時須注意盡量選用同一批號的試劑盒。與手工操作相比，自動化檢測對于試劑的消耗也更多，也需要與操作人員進行一定時間的磨合，才能實現良好的人機交互。總之，不同的實驗室需基于自身的應用需求選擇更適合自身的自動化產品。

全自動酶免工作站可全面提升我們實驗室的自動化和標準化水平，使實驗的穩定性和重復性都得到顯著提高和完善，在降低實驗人員勞動強度情況下提高了工作效率，縮短了重復勞動時間，使科研工作者可以將更多的時間投入到廣闊的研究領域中。

參考文獻：

[1]? Wide L， Porath J. Radioimmunoassay of proteins with the use of Sephadex-coupled antibodies[J]. Biochem Biophys Acta， 1966，30： 257-60.

[2]? Lequin，R.M.Enzyme Immunoassay （ELISA）/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay （ELISA）[J].Clinical Chemistry， 51（12）：2415-8.

[3]? 朱美芹， 王莉莉. Tecan Freedom Evolyzer-2200全自動酶免疫分析儀應用評價[J].實用醫技雜志， 2013， 020（010）：1090-1092.

[4]? 戴蕾，畢永春，宋景秋，等.TECAN Freedom EVOlyzer全自動酶免分析一體機的應用體會[J]. 醫療衛生裝備， 2012， 033（008）：135-136.

[5]? 吳再輝.全自動免疫工作站的設計開發[D].長春：長春理工大學，2018.