雞傳染性法氏囊病毒新型變異株的分離鑒定

嚴專強 尹麗娟 劉琳琳 楊德鴻 梁曉穎 魏曉娜 黃建飛 周慶豐

摘? 要：本研究通過病毒分離、RT-PCR和測序分析等方法，從廣東某肉雞場發生法氏囊和胸腺嚴重萎縮的雞群中分離了1株傳染性法氏囊病毒，命名為GD2020株。氨基酸序列分析結果顯示，分離株VP2基因高變區與近期國內分離的法氏囊病毒新型變異株SHG115株同源性為99.1%，與早期變異株Variant E株同源性為97.5%，與經典毒株、超強毒株和弱毒株同源性在89.3%～94.1%之間。進化分析結果表明，GD2020株與SHG115株屬于同一分支，與早期變異株和經典毒株親緣關系較遠。GD2020株感染不引起雞只死亡和出現腿肌出血等典型臨床癥狀，但能引起法氏囊嚴重萎縮。本研究為廣東地區傳染性法氏囊病的防控提供了數據支持。

關鍵詞：傳染性法氏囊病毒;新型變異株;分離鑒定;VP2基因

中圖分類號：S858.31? ? ?文獻標識碼：B? ? ?文章編號：1673-1085（2020）7-0050-03

雞傳染性法氏囊病（Infectious bursal disease，IBD）是由IBD病毒（Infectious bursal disease，IBDV）引起的一種雞的急性、高度接觸傳染性、溶淋巴細胞性的免疫抑制性傳染病[1]。IBDV主要感染3～6周齡的青年雞，感染后法氏囊先出現充血水腫，再嚴重萎縮，導致法氏囊中淋巴濾泡被大量破壞，引起雞只急性發病甚至死亡[2]。IBDV屬于雙RNA病毒科禽雙RNA病毒屬， 有血清I型和血清II型， 僅血清I型對雞有致病性。根據致病性和病毒中和試驗可將血清I型IBDV分為經典株、變異株、超強毒株和弱毒株[1]。

免疫接種是控制IBD的主要方法。IBD疫苗種類繁多，包括全病毒滅活疫苗、亞單位疫苗、HVT載體疫苗、弱毒疫苗及抗原抗體復合物疫苗等。近年來，由于疫苗的合理使用，IBDV超強毒株在田間爆發頻率逐漸降低。然而，哈爾濱獸醫研究所近期的一項調查結果顯示IBDV新型變異株開始在我國廣泛流行，研究人員于2017～2019年間，從黑龍江、吉林、遼寧、河北、北京、山東、山西、福建、江蘇、安徽、湖北、浙江和云南等13個省份的免疫雞群中分離了82株新型變異毒株，這表明在用的IBDV疫苗可能不能保護新毒株的感染[3-4]。本研究對近期廣東省分離的IBDV毒株進行了基因序列分析，以期為該病的有效防控提供參考數據。

1? 材料與方法

1.1? 臨床樣品采集與病毒分離? 發病雞群弱小雞偏多，均勻度在80%以下，剖檢可見法氏囊和胸腺嚴重萎縮。采集發病雞的法氏囊和脾臟組織，剪碎，加入5倍量2000IU/mL的青霉素、鏈霉素研磨成糜狀，移入滅菌離心管中，在4℃的冰箱中放置3h后，反復凍融3次，8000rpm離心5min，取上清經絨毛尿囊膜途徑接種10～12日齡SPF雞胚。孵化6d后，從人工氣室端剝去卵殼，觀察膜上有無增厚或痘斑病變，并收集活胚和48h后死胚的絨毛尿囊膜，研磨后-80℃備用。

IBDV超強毒株DH2017株由本實驗室保存。使用10～12日齡SPF雞胚測定新分離毒株和經典毒株效價。

1.2? RT-PCR檢測? 取1.1中收集的絨毛尿囊膜研磨液，離心后取上清，按照RNAiso Plus試劑盒說明書提取總RNA。

使用TaKaRa公司PrimeScript One-Step RT-PCR試劑盒進行VP2基因擴增（上游引物：5′-GCCGATGATTACCAATTCTCATC-3′;下游引物：5′-CCGGATTATGTCTTTGAAGC-3′），反應條件為： 50℃ 30min;94℃ 3min;94°C 40s，53°C 40s，72°C 40s，共進行30個循環; 72℃ 10min。用1%瓊脂糖電泳檢測擴增產物，陽性樣品送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3? VP2基因測序與分析? 用DNAStar軟件對分離株與參考毒株VP2基因核苷酸序列及其推導的氨基酸序列進行同源性分析。使用MEGA-X軟件鄰位相接法構建進化樹。

1.4? 致病性試驗? 新分離毒株和實驗室保存的超強毒株分別經口服途徑接種10只28日齡SPF雞，攻毒劑量為106EID50/0.2mL。攻毒后每天觀察雞只臨床癥狀，攻毒后2d和14d剖殺5只/組雞觀察法氏囊和腿肌病變。

2? 結果

2.1? 病毒分離鑒定與測序結果分析? 臨床病料接種SPF雞胚后，培養6d未出現死胚。雞胚絨毛尿囊膜研磨液RT-PCR檢測結果顯示IBDV陽性，分離毒株命名為GD2020株。

基因測序獲得位于VP2基因631～1347nt的717bp長度的序列。對獲得的序列進行同源性分析顯示，分離株和新型變異株SHG115株同源性最高，核苷酸和氨基酸同源性分別為98.3%和99.1%;與早期變異株同源性偏低，核苷酸同源性僅為94.3%，見表1。

2.2? 氨基酸序列變異分析? GD2020株具有變異株的特征性氨基酸222T、249K和286I，但不具有變異株特征性氨基酸254S。和早期變異株相比，GD2020株和SHG115株發生了5個氨基酸突變，分別為221K、252I、254N、263Y和299S，其中263Y和299S是經典毒株和超強毒株的特征性氨基酸，見圖1。

核苷酸和氨基酸比對結果表明GD2020株屬于變異株，但和早期的變異株相比，GD2020株又具有部分經典毒株和超強毒株的特點，屬于新型變異株。

2.3? 遺傳進化分析? 遺傳進化分析結果表明，GD2020株與IBDV新型變異株SHG115株屬于同一分支，與早期變異株和經典毒株親緣關系較遠，見圖2。

2.4? 致病力分析? 口服接種SPF雞后2d，超強毒株組死亡2只，新型變異株組無死亡。剖檢可見超強毒株組和新型變異株組雞只均出現法氏囊水腫，超強毒株組雞只的法氏囊和腿肌嚴重出血，而新型變異株組雞只的法氏囊僅有輕微出血，腿肌正常。攻毒后14d，超強毒株組和新型變異株組雞只法氏囊均出現嚴重萎縮，見圖3。

3? 討論

血清Ⅰ型的IBDV遍布全世界，基本所有的家禽主產區都有IBD發生，嚴重威脅著世界養雞業的發展[4-5]。盡管各種疫苗在防控傳染性法氏囊病中起到了重要作用，但隨著美國變異株、歐洲超強毒株和中國新型變異株的出現，常造成雞群的免疫失敗，導致一定的經濟損失，現今IBD仍是養禽業防控的重要對象[4]。本研究從廣東某肉雞場發生法氏囊和胸腺嚴重萎縮的雞群中分離到1株法氏囊新型變異株病毒，該病毒感染不引起雞只死亡和出現腿肌出血等典型臨床癥狀，但攻毒后最早4d就可見法氏囊嚴重萎縮，推測該雞場出現的高比例的弱小雞問題可能與IBDV引起的免疫抑制有關。

早期研究發現，通過部分特征性氨基酸可以區分不同類型的IBDV毒株，這些氨基酸分別為超強毒株的222A、256I、294I和299S，變異株的249K和254S以及弱毒株的253H、279N、284T和330R[6]。本研究分離毒株和早期變異株相比，發生了多個氨基酸突變，其中212D和263Y與經典毒株氨基酸序列相同，299S是超強毒株的特征性氨基酸，提示IBDV新型變異株可能是早期變異株和經典毒株的重組病毒。為了有效控制IBDV新型變異株感染，病毒流行動態監控、現有疫苗保護效果評價和新疫苗研發等工作需要繼續開展。

參考文獻：

[1]? Muller H， Islam M R， Raue R. Research on infectious bursal disease--the past， the present and the future [J]. Vet Microbiol， 2003：97（1-2）： 153-165.

[2]? Saif YM.禽病學[M].第十二版.北京：中國農業出版社，2012：951-952.

[3]? Fan L， Wu T， Hussain A， et al. Novel variant strains of infectious bursal disease virus isolated in China [J].Vet Microbiol， 2019：230： 212-220.

[4]? 范林進，王雨龍，吳甜甜，等.我國傳染性法氏囊病病毒新型變異株分析研究[J].中國預防獸醫學報， 2019：41（11）：1164-1169.

[5]? 劉存霞，費亦東，王銳，等. 吉林地區一株雞傳染性法氏囊病毒的分離與鑒定[J].家禽科學，2018：（10）：5-9.

[6]? Ren X， Xue C， Zhang Y， et al. Genomic analysis of one Chinese strain YS07 of infectious bursal disease virus reveals unique genetic diversity [J]. Virus Genes. 2009：39（2）：246-8.