菠蘿蜜莖葉全長轉錄組分析

潘敏 于旭東 蔡澤坪 李佳佳 羅佳佳 周丹 楚文清 瞿倩

摘??要：菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllus）是熱帶地區重要的木本植物，具有較高的經濟價值。試驗以菠蘿蜜正常及葉綠素合成缺失突變體幼苗為研究材料，在PacBio Sequel平臺上進行莖葉全長轉錄組測序，最終得到95?701個Isforms，在對轉錄本進行聚類糾錯后利用NR、NT、GO、KOG、KEGG、Swiss-Prot、InterPro?7個數據庫進行功能注釋，共有93?367個轉錄本被注釋。七大數據庫中分別有92?187（NR）、90?326（NT）、74?548（Swiss-Prot）、75?396（KEGG）、77?022（KOG）、81?906（InterPro）和65?500（GO）個轉錄本獲得功能注釋。共檢測到85?091個CDS和55?608個SSR序列，并預測到了4?753個轉錄因子（Transcription Factors，TFs），1?667個轉錄調控子（Transcriptional Regulators，TRs）以及4?710個受體激酶（Receptor-like Kinases，RLKs）。

關鍵詞：菠蘿蜜;全長轉錄組;功能注釋中圖分類號：S718.43??????文獻標識碼：A

Transcriptome Data Analysis of Artocarpus heterophyllus Stems and Leaves

PAN Min¹， YU Xudong¹， CAI Zeping^1*， LI Jiajia¹， LUO Jiajia^2，3， ZHOU Dan¹， CHU Wenqing¹， QU Qian¹

1. College of Forestry， Hainan University?/ Key Laboratory of Genetics and Germplasm Innovation of Tropical Special Forest Trees and Ornamental Plants， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China; 2. College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 3. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture?and Rural Affatrs， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract： Artocarpus heterophyllusis an important woody plant in tropical regions withhigh economic value. This test used the normal and chlorophyll deficient mutant ofA. heterophyllusseedlings as the research materials. The transcriptome of the stems and leaves was sequenced by PacBio Sequel， 95?701 isoformswerefinally found. After cluster and polish， using NR， NT， GO， KOG， KEGG， Swiss-Prot and InterPro 7 databases for functional annotation， a total of 93?367 transcripts were annotated. There were 92?187 （NR）， 90?326 （NT）， 74 548 （Swiss-Prot）， 75?396 （KEGG）， 77?022 （KOG）， 81?906 （InterPro） and 65 500 （GO） transcripts annotated in the seven databases respectively. In addition， a total of 85?091 CDS and 55 608 SSR sequences were detected， 4?753 transcription factors， 1?667 transcriptional regulators and 4?710 receptor-like kinases were predicted.

Keywords： Artocarpus heterophyllus; transcriptome; functional annotation

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.07.002

菠蘿蜜（Artocarpus heterophyllus）為桑科（Moraceae）木波羅屬（Artocarpus），在食用、藥用、園林、經濟等方面都具有較高價值^[1]。當前，關于菠蘿蜜的研究大多集中在生長發育、果實開發利用、病害防治等方面^[2-4]。對于分子生物學方面研究較少。目前已有菠蘿蜜花被轉錄組分析報道，但有關莖葉的報道還未出現^[5]。由于缺乏基因組序列，所以分子生物學方面的研討受到限制。

在果樹植物的研究領域中，葡萄（Vitis vinifera）是第一個完成全基因組測序的物種^[6]。至今已有數十種果樹的基因組序列相繼問世，其中包含熱帶水果香蕉（Musa nana）和菠蘿（Ananas comosus）^[7-8]。基因組測序的完成能夠加深對物種的了解并加快分子育種的速度^[9]。目前桑科植物中只有川桑（Morus notabilis）完成了基因組測序^[10]。因此，研究菠蘿蜜轉錄組測序可豐富其分子信息，為研究其他桑科植物提供參考^[11]。

第三代測序技術具有讀長長的優點，可快速簡便地獲得大量轉錄本序列，實現更多新基因的挖掘^[12]。近年來，三代測序是開發基因組資源以及分子標記的一種重要途徑，此技術已經在無參考基因組的條件下為多種植物建立了轉錄組數據庫^[13]。本研究利用PacBio Sequel平臺對菠蘿蜜進行全長轉錄組測序，不僅為二代測序數據拼接提供模板，還為進一步探索莖葉基因表達奠定基礎。

1 ?材料與方法

1.1材料

組織樣品采自生長40 d的白化和正常菠蘿蜜幼苗^[14]，取其成熟葉、嫩莖和老莖節間進行混樣后液氮中速凍和保存，用于RNA提取。

1.2方法

1.2.1 ?RNA提取和檢測??將樣品放入含有液氮的研缽中充分研磨成粉末，轉入放有裂解液的EP管中，采用CTAB法提取RNA^[15]。取適量樣品進行檢測，于?80?℃保存。RNA提取流程與檢測均委托華大基因公司進行。

1.2.2 ?文庫構建和測序??在PacBio Sequel平臺上測序菠蘿蜜樣本并建立PacBio ISO-Seq文庫，得到原始聚合酶讀取序列。讀取序列去接頭，用SMRT analysis套件^[16]進行插入片段識別（reads of insert， ROI）、分類、聚類和校正，最終獲得高質量的全長一致性序列。將各個文庫的高質量全長序列合并到一起，在無參考基因組的情況下，使用cd-hit對聚類和糾錯后的轉錄本去冗余。轉錄組測序委托華大基因公司進行。

1.2.3 ?CDS預測和SSR檢測??使用TransDecoder. LongOrfs（https：//transdecoder.github.io）對Unige ne.fa進行開放閱讀框搜索，提取長讀碼框序列。基于序列相似性用Diamond Blastp將Unigene.fa比對到Swiss-Prot數據庫中，利用Hmmscan對BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）結果在Pfam數據庫篩選。利用TransDecoder.Predict預測Unigene.fa的編碼序列。使用MISA^[17]?（http：//pgrc.?ipk-gatersleben.de/misa）對轉錄本進行SSR檢測。

1.2.4 ?功能注釋??利用BLAST^[18]對轉錄本進行NR、NT、KOG、KEGG和Swiss-Prot注釋。使用Blast2GO^[19]以及NR注釋結果進行GO注釋，使用InterProScan5^[20]進行InterPro注釋。使用iTAK在線工具（http：//itak.feilab.cn）鑒定轉錄因子（transcription factors，TFs）、轉錄調控子（transcriptional regulators，TRs）以及受體激酶（receptor-like kinases，RLKs）。

2??結果與分析

2.1 數據質控

在PacBio Sequel平臺上，將菠蘿蜜正常及白化病的莖、葉混合樣品進行全長轉錄組測序，共建立一個PacBio ISO-Seq文庫，原始數據聚合酶讀取（polymerase reads）序列中，總讀取共有490?303個（13.58?GB）。其中，最大聚合酶讀取（polymerase reads）序列長度為210?091?bp，N50為49?592?bp。最大聚合酶讀取（polymerase reads）經過處理后得到的Subreads共有8?661?811個（12.80?GB），Subreads最大長度為132?829?bp，N50為1835 bp。

通過插入片段的識別，將來自同一環狀分子的Subreads聚類在一起，在總共1個SMRT cell的測序中平均檢測13次后得到893?030?085?bp的CCS（circular consensus sequencing）數據量。reads測序平均長度和平均質量值分別為1882?bp和0.94，可充分體現試驗數據的可靠性，插入片段（reads of insert，ROI）共有474 542個。

在所有的ROI中，全長非嵌合序列（full-length?non-chimeric reads）共有319?878個，占67.41%，其次是非全長序列（non-full-length reads）占26.97%;嵌合體序列（chimeric）以及短序列（short reads）只占極少數，分別為3.05%和2.57%，可以看出只有極少數reads為嵌合reads（圖1）。

全長非嵌合序列被聚類成一致性序列共有189 629個，后續分析只采用了high QV的一致性序列125 429個。每個文庫聚類和糾錯后得到的高質量序列最終合并到一起去冗余，得到轉錄本95 701個（表1、圖2）。轉錄組測序數據已經上傳至NCBI的SRA數據庫，登錄號PRJNA579273。

2.2 ?CDS預測

對轉錄組進行CDS（coding sequence）預測，共獲得序列85?091個。片段大小297～6240 nt，總長度為93?949?176?nt。其中，長度在100～500?nt的片段有12?833個，占15.0%;500～1000?nt的有29?699個，占34.9%;1000～1500?nt的有23?147個，占27.2%;1500～2000 nt的有12 381個，占14.6%;長度>2000 nt的有7031個，占8.3%。序列片段大小大多數處于1000～2000?nt，說明菠蘿蜜莖葉轉錄組的質量處于良好狀態（圖3A、表2）。

2.3 ?SSR檢測

對轉錄本進行SSR檢測，結果表明總共有55?608個序列。其中，最占優勢的是單核苷酸重復（27?746），占比49.9%，其次是二核苷酸（13?734）占24.7%，三核苷酸（11?120）占20.0%，四核苷酸、五核苷酸以及六核苷酸占極少數，分別為1.38%、1.71%和2.31%。

在檢測到的結果中，二核苷酸里AG/CT最多（9300），最少的是CG/CG（19）。在三核苷酸里AAG/CTT最多（3860），最少的是ACT/AGT（109）（圖3B）。

2.4功能注釋

將轉錄本與各大功能數據庫比對，分別有92?187（NR）、90?326（NT）、74?548（Swiss-Prot）、75?396（KEGG）、77?022（KOG）、81?906（InterPro）和65?500（GO）個基因獲得功能注釋（表3）。

注：Intersection：被七大數據庫中所有數據庫注釋上的轉錄本總數及比例;Overrall：被七大數據庫中任意一個數據庫注釋上的轉錄本總數及比例。

Note： Intersection： Total number and proportion of transcripts annotated by all databases in seven databases; Overrall： Total number and proportion of transcripts annotated by any one of the seven databases.

2.4.1 ?NR注釋分類??NR注釋中相同轉錄本能比對上的較多相似物種有川桑（Morus notabilis）、棗樹（Ziziphus jujuba）、核桃（Juglans regia）和櫻桃（Prunus avium），且所占比例分別為71.26%、8.25%、1.53%和1.44%，另外比對到其他已知物種比例為17.52%（圖4A）。

轉錄組在與NR、InterPro、Swiss-Prot、KOG和KEGG 5個數據庫比對之后分別特有的轉錄本數為1998、30、9、9和15個。NR與InterPro的相同轉錄組最多有81 866個，關系最為緊密。其中InterPro與KOG、InterPro與KEGG、KOG與KEGG共有的轉錄本為0（圖4B）。

2.4.2 ?KOG功能分布統計??KOG數據庫共有?77 022個轉錄本被注釋，根據功能大致可分為25類。功能種類比較全面，參與了較多的生命活動。一般功能預測（general function prediction）占最多（17?987），其次是信號轉導機制（signal transdu ction mechanisms）（13 308）和翻譯后修飾蛋白質翻轉折疊（posttranslational modification， protein turnover，chaperones）（9769），細胞運動（cell motility）數量最少（189）（圖5A）。

圖A中1：翻譯核糖體結構和生物組成;2：轉錄;3：信號傳導機制;4：次級代謝產物的合成運輸、分解;5：RNA加工與修飾;6：復制、重組與修復;7：翻譯后修飾蛋白質翻轉折疊;8：核算運輸和代謝;9：核結構;10：脂質運輸和代謝;11：細胞外分泌物的運輸;12：無機離子運輸和代謝;13：大致預測一般功能;14：未知功能;15：胞外結構;16：能量的產生與轉換;17：防御機制;18：細胞骨架;19：輔酶的運輸和代謝;20：染色質結構與運動;21：細胞膜/包膜生物合成;22：細胞運動;23：細胞周期調控;24：碳水化合物運輸與代謝;25：氨基酸運輸與代謝。圖B中，1：運輸和代謝;2：信號傳導;3：膜轉運;4：轉運;5：折疊、分選和降解;6：翻譯;7：復制折疊;8：全局和概覽圖;9：碳水化合物代謝;10：氨基酸代謝;11：類脂化合物代謝;12：能量代謝;13：輔助因子和維生素代謝;14：其他次級生物代謝;15：核苷酸代謝;16：其他氨基酸代謝;17：聚糖生物合成與代謝;18：萜類和酮類化合物代謝;19：環境適應;20：消化系統。圖C中，1：細胞過程;2：代謝進程：3：生物調節;4：生物進程調控;5：應激反應;6：定位;7：組織或生物起源細胞組件;8：信號傳導;9：多細胞生物過程;10：發育進程;11：繁殖;12：繁殖進程;13：生物過程的負調控;14：多生物過程;15：生物進程的正調控;16：生長;17：免疫系統過程;18：節律進程;19：細胞增殖;20：碳利用;21：脫毒;22：生物粘附;23：氧素利用;24：移動;25：細胞;26：細胞部分;27：細胞膜;28：膜部分;29：細胞器;30：高分子配合物;31：細胞器的部分;32：膜包圍內腔;33：胞外區;34：病毒;35：病毒組分;36：超分子絡合物;37：細胞連接;38：共質體;39：胞外區域部分;40：擬核;41：連接;42：催化活性;43：載體活性;44：轉錄調節活性;45：結構分子活性;46：分子功能調節器;47：信號傳導活性;48：抗氧化活性;49：分子傳感器活性;50：養分貯液囊活性;51：分子載體活性;52：蛋白質標記物;53：翻譯調節活性。

A：?Functional distribution of KOG annotation; B： Functional distribution of KEGG annotation; C： Functional distribution of GO annotation.

In figure A， 1： Translation， ribosomal structure and biogenesis; 2： Transcription; 3： Signal transduction mechanisms; 4： Secondary metabolites biosynthesis， transport and catabolism; 5： RNA processing and modification; 6： Replication， recombination and repair; 7： Posttranslational modification， protein turnover， chaperones; 8： Nucleotide transport and metabolism; 9： Nuclear structureLipid transport and metabolism; 10： Lipid transport and metabolism; 11： Intracellular trafficking， secretion， and vesicular transport; 12： Inorganic ion transport and metabolism; 13： General function prediction only; 14： Function unknown; 15Extracellular?structures; 16： Energy production and conversion; 17 Defense mechanisms; 18 Cytoskeleton; 19： Coenzyme transport and metabolism; 20： Chromatin structure and dynamics; 21： Cell wall/membrane/ envelope biogenesis; 22： Cell motility; 23 Cell cycle control， cell division， chromosome partitioning; 24： Carbohydrate transport and metabolism; 25： Amino acid transport and metabolism. In figure B， 1： Transport and catabolism; 2： Signal transduction; 3： Membrane transport; 4： Translation; 5： Folding， sorting and degradation; 6： Transcription; 7： Replication and repair; 8： Global and overview maps; 9： Carbohydrate metabolism; 10： Amino acid metabolism; 11： Lipid metabolism; 12： Energy metabolism; 13： Metabolism of cofactors and vitamins; 14： Biosynthesis of other secondary metabolites; 15： Nucleotide metabolism; 16： Metabolism of other amino acids; 17： Glycan biosynthesis and metabolism; 18： Metabolism of terpenoids and polyketides; 19： Environmental adaptation; 20： Digestive system. In figure C， 1： Cellular process; 2： Metabolic process; 3： Biological regulation; 4：Regulation of biological process; 5： Response to stimulus; 6： Localization; 7： Cellular component organization or biogenesis; 8： Signaling; 9： Multicellular organismal process; 10： Developmental process; 11： Reproduction; 12：Reproductive process; 13： Negative regulation of biological process; 14： Multi- organism process; 15： Positive regulation of biological process; 16： Growth; 17： Immune system process; 18： Rrhythmic process; 19： Cell proliferation; 20： Carbon utilization; 21： Detoxification; 22： Biological adhesion; 23： Nitrogen utilization; 24： Locomotion; 25： Cell; 26： Cell part; 27： Membrane; 28： Membrane part; 29： Organelle; 30： Macromolecular complex; 31： Organelle part; 32： Membrane-enclosed lumen; 33： Extracellular region; 34： Virion; 35： Virion part; 36： Supramolecular complex; 37： Cell junction; 38： Symplast; 39： Extracellular region part; 40： Nucleoid; 41： Binding; 42： Catalytic activity; 43： Transporter activity; 44： Transcription regulator activity; 45： Structural molecule activity; 46： Molecular function regulator; 47： Signal transducer activity; 48： Antioxidant activity; 49： Molecular transducer activity; 50： Nutrient reservoir activity; 51： Molecular carrier activity; 52： Protein tag; 53： Translation regulator activity.

續圖5 功能注釋

Fig. 5 ?Function notes?（continued）

2.4.3 ?KEGG功能分布統計??KEGG數據庫共注釋到75 396個轉錄本。根據代謝途徑可分為5個分支，細胞加工（cell processing）（3215）、環境信息處理（environmental information processing）（4592）、遺傳信息處理（genetic information processing）（16 305）、代謝（metabolism）（41?632）和有機體系統（organist system）（2928）。參與代謝途徑中數量最多的通路是全局和概覽圖（global and overview maps）（16 331），其次為碳水化合物代謝（carbohydrate metabolism）（6758）（圖5B）。

2.4.4 ?GO功能分布統計??GO數據庫中共有65?500個轉錄本被注釋。可分為生物過程（biological processes）（85 290）、細胞組成（cell composition）（117?187）和分子功能（molecular function）（75 861）3大類53分支。細胞組成中細胞（Cell）占最多（22?816），擬核（nucleoid）最少（30）;生物過程中最多的是細胞過程（cellular process）（24?569），其次是代謝進程（metabolic process）（23?323），移動（locomotion）最少（8）;執行分子功能這一大類中連接（binding）（34?271）和催化活性（catalytic activity）（32?416）數量最多，翻譯調節活性（translation regulator activity）最少（3）（圖5C）。

2.5 預測TFs、TRs以及RLKs

95?701個序列共預測出TFs 4753個，66個TF家族，其中GRAS家族最多（327），其次是bHLH（321）;最少的家族是ULT（2）（圖6、表4）。

共預測出TRs?1667個，共有23個TR家族，其他家族有360個。數量最多的是AUX/IAA家族（214），其次是家族TRAF（144），最少的家族是MED7（4）（圖7、表4）。

RLKs位于細胞膜上在植物信號傳導過程起重要作用。通過數據檢測到4710個RLKs，共分為72個家族。其中亮氨酸重復類受體激酶（leuc ine repeat receptor-like kinases，LRR-RLKs）和胞內受體激酶（receptor-like cytoplasmic kinases，RLCKs）分別有961和572個，分別含有23和17個亞家族（圖8、表4）。

3 ?討論

本研究采取第三代高通量測序技術結合生物信息學分析，得到菠蘿蜜全長轉錄組數據。通過聚類糾錯去冗余得到最終高質量序列9501個和N50為1949?bp，可看出三代測序讀長長且連續性較高^[21]。對轉錄組序列進行編碼區域預測，根據結果顯示，N50大于1000 bp且GC含量穩定說明序列組裝完整性較高，可以為后續SSR檢測及功能注釋分析提供保障。在本試驗檢測到的SSR序列中，屬單核苷酸重復最多，接近總SSR的一半。另外，二核苷酸以及三核苷酸重復數量均在一萬以上，三者都可以為未來SSR分子標記開發奠定基礎。

通過公共數據庫對轉錄組比對分析，共有93?367個序列成功注釋，占比97.56%，充分表明三代測序結果的較高精確性。推測剩余的2334條序列未被注釋的原因可能是由于本身是非編碼序列或者不完整序列^[22]。根據NR注釋情況來看，注釋到川桑基因最多，體現了菠蘿蜜與其親緣性較高，也為將來二者基因表達詳細比較提供充分的數據基礎。比較KOG、KEGG、GO 3個數據庫功能統計情況，發現注釋到KOG的轉錄本數最多，其中以一般功能、信號轉導機制、核酸運輸和代謝的相關基因最為豐富。

由于菠蘿蜜基因組還未被測序，限制其在分子生物學方面的研究。Hu等^[5]對菠蘿蜜花被進行轉錄組測序，得到32?495個高質量序列。本試驗所獲得的高質量序列比花被多的原因也許是由于測序的組織混合樣品較多。花被高質量序列在七大數據庫中獲得功能注釋的基因占比40%～80%，相對而言莖葉略比花被注釋到的基因多，出現此結果差異也許是因為器官組織不同。

TFs調控眾多基因表達，掌握其家族分類可對其功能有更深入的了解^[23]。在TFs中，bHLH家族共有321個，目前已有關于桑樹bHLH家族分析的報道^[24]。本研究預測菠蘿蜜體內的TFs、TRs、RLKs數量以及詳細的家族分類，為未來研究抗性基因表達以及詳細的家族分析提供數據。

本研究的轉錄組數據和各項結果豐富了菠蘿蜜的分子信息，可為未來二代測序差異表達基因提供模板，進一步討論其關于分子生物學方面的研究。

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