蟬擬青霉疏水蛋白PChyd基因表達模式分析及敲除載體構建

王麗芳 彭耀 黨向利 葉良 李雙姣 許慧慧 杜鵑 董育德

摘 ?要：為深入研究昆蟲病原真菌蟬擬青霉疏水蛋白PChyd基因的功能，根據蟬擬青霉基因組信息克隆疏水蛋白PChyd基因，對該基因序列進行生物信息學分析，使用qRT-PCR技術對其在不同培養條件或階段下的表達模式進行分析，并通過酶切酶連的方法構建了該基因的敲除載體。結果表明：PChyd基因的開放閱讀框序列全長303?bp，編碼100?aa，包含22?aa的信號肽序列和70?aa疏水蛋白功能區域。系統發育分析顯示該基因與粗糙蟲草菌親緣關系最近。qRT-PCR結果顯示PChyd基因在PDA培養的菌絲體、誘導的附著胞、誘導的芽生孢子中表達量顯著高于另外2個樣品，其中芽生孢子表達量最高，暗示該基因在蟬擬青霉侵染初期和在昆蟲血腔中定殖階段可能具有重要作用。凝膠電泳結果表明，成功構建了該基因的敲除載體，擴增出含有上臂、HPH、下臂的3356?bp左右的片段。本研究為進一步探究蟬擬青霉疏水蛋白PChyd基因的致病機理、生防工程菌的改造奠定了基礎。

關鍵詞：蟬擬青霉;疏水蛋白;PChyd：表達模式;敲除載體中圖分類號：Q78;S476.12??????文獻標識碼：A

Analysis of Expression Pattern and Construction of Knockout Vector ofPChydGeneof?Paecilomyces cicadae

WANG Lifang¹， PENG Yao^2*， DANG Xiangli²， YE Liang²， LI Shuangjiao²， XU Huihui²， DU Juan²，DONG Yude¹

1. School of Horticulture， Anhui Agricultural University， Hefei， Anhui 230036， China; 2.?School of Plant Protection， Anhui Agricultural University， Hefei， Anhui 230036， China

Abstract： In order to investigate the function ofPChydofPaecilomyces cicadae， the gene was cloned according to the genomic data ofP. cicadae， and the bioinformatics of the gene were analyzed by the NCBI database and the Expasy online tools. The expression pattern ofPChydwas analyzed under different culture conditions or stages by qRT-PCR. The knockout vector of the gene was constructed by molecular biological methods. The open reading frame ofPChydwas 303 bp encoding 100 aa. Domain analysis revealed that the gene contained a 22 aa signal peptide region and a 70 aa hydrophobin functional region. Phylogenetic analysis showed that the relationship ofP. cicadae PChyd was close toCordyceps confragosa hydrophobin. Expression pattern analysis showed that the expression level ofPChydin mycelium in PDA， appressorium and blastospore were significantly higher than that of the other two samples， and the expression level was the highest in blastospore among five samples， which indicating that this gene had important function in the initial stage of the infection ofP. cicadaeand in the colonization stage of insect blood. The results of gel electrophoresis and sequencing showed that the knockout vector of the gene was successfully constructed. The research would lay a foundation for further exploring of the pathogenic mechanism ofPChydand engineering this entomopathogenic fungusP. cicadae.

Keywords： Paecilomyces cicadae; hydrophobin;PChyd; expression pattern; knockout vector

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.07.005

隨著害蟲抗藥性的增強、害蟲的再猖獗以及農業投入物對環境的污染這一系列問題的出現，人們迫切需要尋找以生物為基礎的有害生物控制形式。昆蟲病原真菌作為一種重要的微生物群，廣泛分布于整個真菌界，已經作為害蟲生物防治的主要手段之一并應用于農業生態系統中。當前害蟲生物防治中廣泛應用的昆蟲病原真菌包括金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）、球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、玫煙色擬青霉（Paecil omycesfum osoroseus）和蠟蚧輪枝菌（Verticillium lecanii）^[1]。蟬擬青霉（Paecilomyces cicadae）是一種在同翅目和鱗翅目昆蟲幼蟲上發現的昆蟲病原真菌，它能夠侵染竹蟬（Platylomia pieli）、山蟬（Cicada flammata）、小菜蛾（Plutella xylostella）等昆蟲^[2-3]。在我國，該菌是研究較早的蟲草菌和生防菌種類之一，目前主要分布于我國華東與西南地區^[4]。早期主要研究了其對菜粉蝶（Pieris rapae）等鱗翅目農業害蟲的致病性^[5]。隨著人們對蟲草的關注度逐漸升高，近年來關于蟲草屬菌種的研究越來越多。研究表明蟬擬青霉對鱗翅目（Lepidoptera）、半翅目（Hemiptera）、同翅目（Homoptera）等昆蟲都具有較強的致病能力^[6-8]。這些研究為后期蟬擬青霉的開發利用提供了理論基礎。

為提高昆蟲病原真菌的田間穩定性、殺蟲效果和殺蟲速度，國內外學者對病原真菌致病性的分子機制展開了研究。當前白僵菌與綠僵菌致病毒力基因的研究已有大量報道，但對蟬擬青霉毒力相關基因的研究甚少，在一定程度上限制了該菌在害蟲生物防治上的應用。在前期的研究中，本課題組對蟬擬青霉菌株（ZJ1611）基因組進行了測序。根據已報道的白僵菌、綠僵菌等昆蟲病原真菌的毒力相關基因，對蟬擬青霉基因組中的毒力相關基因進行篩選，從中發現1個疏水蛋白（hydrophobin）基因——PChyd。疏水蛋白是一種存在于絲狀真菌中、分子量較小、具有表面活性的分泌蛋白，常分布于分生孢子、菌絲等結構的表面，該蛋白根據其自身的親水模式、溶解特性、核苷酸序列以及自組裝過程中所形成的結構可分為2種類型（I型和II型）^[9-11]。疏水蛋白在真菌中扮演著多種重要的角色。例如，在食用真菌中，Hyd9基因的沉默會造成金針菇（Flammulina filiformis）菌絲減少，并對原基形成產生影響^[12]。Zhang等^[13]研究發現白靈菇（Pleurotus nebrodensis）疏水蛋白PN1與細菌抵抗力有關。在生物防治真菌粉紅螺旋聚孢霉（Clonostachys rosea）中，疏水蛋白對分生孢子的疏水性、控制分生孢子萌發以及粉紅螺旋聚孢霉在根內定殖都有一定作用^[14]。這些研究都表明疏水蛋白在真菌的生長和發育過程中具有重要的作用。

目前關于蟬擬青霉疏水蛋白基因的研究尚未見報道。鑒于此，對蟬擬青霉基因組中發現的疏水蛋白PChyd基因進行克隆，利用生物信息學方法對其序列進行分析，對其在不同培養條件或階段的表達模式進行檢測，并成功構建了該基因的敲除載體。為進一步探究蟬擬青霉疏水蛋白PChyd基因的致病機理奠定基礎，同時為該菌生防工程菌的改造以及生防菌的應用提供理論依據。

1 ?材料與方法

1.1 材料

蟬擬青霉（P.cicadae）菌株分離自采集于浙江的野生蟬蟲草子實體（編號：ZJ1611）。質粒pMD19-T和大腸桿菌Escherichia coliDH5α感受態細胞購自TaKaRa。Bar-HPH由安徽農業大學植物保護學院郭敏教授饋贈。

1.2方法

1.2.1PChyd基因的克隆與鑒定 ?采用Primer 5.0軟件對預測的PChyd基因設計克隆引物，引物序列詳見表1，以cDNA為模板對PChyd基因進行PCR擴增。以DNA為模板進行PCR反應來分析基因序列中是否存在非編碼區域。PCR反應根據2×Taq Plus MasterMix（北京康為）試劑的使用說明在PCR儀（Bio-RAD）中進行。產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，并使用上海生工膠回收試劑盒對反應產物進行膠回收、純化，回收后的產物使用Mighty TA-cloning（TakaRa）試劑盒進行TA克隆，克隆好的質粒用于大腸桿菌E. coliDH5α的轉化，并挑選已成功驗證的轉化子寄往安徽通用生物公司進行測序，以驗證基因組測序序列的正確性，對驗證正確的基因進行后續生物信息學及表達模式分析。

1.2.2PChyd基因的生物信息學分析 ?將PChyd基因序列于NCBI上利用BLAST進行比對。根據NCBI提供的InterProScan、dbCAN、CDD

注：下劃線序列為PmeI酶切位點。

Note： The underlined sequences are thePmeI?cleavage site.

databases等在線工具對該基因結構域進行分析。采用ProtParam預測蛋白的等電點（pI）、分子量（Mw）和GPI位點。采用SignalP 4.1預測該蛋白的理論信號肽區域。采用MEGA 6.0軟件構建系統發育樹。

1.2.3??菌株的培養 ?根據PChyd基因可能參與的反應階段，選取了2種不同的菌絲培養條件和3個階段，共5個樣品（PDA、CM、AP、BS、C）。各種樣品的培養方法如下：將蟬擬青霉接種在PDA固體培養基上于28?℃培養12～15?d，使用含有0.05%吐溫80的無菌水收集蟬擬青霉的分生孢子，配置孢子懸浮液，懸浮液濃度為1×10⁸個/mL。蟬擬青霉分生孢子接種到CM^[15]（硝酸鹽溶液50?mL/L，微量元素溶液1?mL/L，維生素溶液1?mL/L，葡萄糖10?g/L，蛋白胨2?g/L，酵母提取物1?g/L，絡蛋白氨基酸1?g/L，瓊脂粉15?g/L）、PDA液體培養基中，在28?℃條件下180?r/min的搖床中培養3 d后收集菌絲體。使用Junges等^[16]報道的實驗方法對分生孢子（C）、芽生孢子（BS）（誘導培養基配方：玉米漿固體30?g/L，葡萄糖40?g/L，酵母提取物30?g/L;培養條件：28?℃?180?r/min培養64?h）和附著胞（AP）（配置含有0.004%酵母提取物和0.05%吐溫80的無菌溶液，使用該溶液將1×10⁸個/mL的孢子懸浮液稀釋至1×10⁶個/mL。稀釋后的孢子懸浮液均勻涂抹于蓋玻片上，并于28?℃培養16?h后，使用上述配置好的溶液沖洗、離心并收集樣品）進行收集。所有試劑均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2.4??基因組DNA、總RNA提取及cDNA合成 ?利用Wizard^?Genomic DNA提取試劑盒（Pro mega）提取各樣品的基因組DNA，提取后的基因組DNA用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。根據Rio等^[17]的方法對所有樣品的總RNA進行提取，并使用RNase-free DNase I（TaKaRa）去除總RNA中的基因組DNA污染。通過瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000分光光度計（Thermo Scientific，DE）對提取的RNA質量和濃度進行檢測。cDNA合成根據PrimeScript^?II 1st Strand cDNA Synthesis試劑盒（TaKaRa）的使用說明進行。

1.2.5??qRT-PCR??使用qRT-PCR對樣品的PChyd基因的相對表達水平進行檢測。每個基因轉錄本的相對熒光定量使用SYBR^?Premix Ex TaqTM II（TaKaRa）試劑進行，并在Bio-Rad CFX96（Bio-?Rad，Hercules，CA，USA）中進行反應。熒光定量反應使用96孔板，每個孔包含20?μL反應液：10?μL SYBR^?Premix Ex TaqTM II、每條引物0.4?μL（0.2?μmol/L）、1?μL（100 ng）cDNA模板、8.2?μL不含核酸酶的無菌水。反應條件如下：95?℃?30?s 1個循環，95?℃?5?s和60?℃?30?s反應40個循環。蟬擬青霉β-actin基因作為內參基因，相對表達水平使用2^-ΔΔCT方法進行分析^[18]。所有的實驗進行3次重復。

1.2.6??敲除載體構建??分別設計引物擴增敲除基因的上下臂片段及抗性基因（表1），按照圖1所示進行該基因敲除載體的構建，構建好的載體送往安徽通用生物公司進行測序驗證。具體實驗方法如下：首先進行Overlap PCR反應，構建含有PChyd左、右臂的片段（引物提前設計同源區域及PmeI酶切位點），回收PCR產物用于TA克隆，TA克隆后的質粒經PmeI酶切處理后（酶切后的產物需去磷酸化處理）與HPH進行T4連接，挑取連接轉化后的大腸桿菌菌落進行PCR驗證。

1.3數據處理

采用GraphPad Prism 7.0和Data Processing System（DPS）軟件進行數據處理和繪圖。數據均為平均值±標準誤，采用SPSS軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 ?PChyd基因克隆與生物信息學分析

以蟬擬青霉的基因組DNA和cDNA為模板，利用設計的特異性引物PC29和PC30進行Pchyd基因的擴增。凝膠電泳結果顯示，從DNA和cDNA

模板中分別擴增出大約400?bp和300?bp片段（圖2），兩者之間有100 bp左右的差異，暗示該基因的序列中存在非編碼區域。將2個PCR產物進行測序，測序結果如圖3所示。蟬擬青霉PChyd基因DNA序列長度為417?bp，比mRNA序列大114?bp，該基因中存在2個非編碼區域（圖3）。將測序序列利用NCBI進行比對，發現該基因編碼的蛋白屬于疏水蛋白hydrophobin-2超家族，并且產物測序結果與基因組序列相一致，可以確認該基因為蟬擬青霉疏水蛋白基因PChyd。

M：1000 bp DNA Marker;—：為不添加模板的擴增，作為陰性對照;DNA：以蟬擬青霉基因組DNA為模板擴增;cDNA：以蟬擬青霉cDNA為模板擴增。

M： 1000?bp DNA Marker; —： Negative control （without DNA template）; DNA： Genomic DNA as template; cDNA： cDNA as template.

圖2蟬擬青霉PChyd基因擴增電泳檢測

綠色突出部分為起始密碼子，紅色突出部分為終止密碼子。

The green highlight is the start codon and the red highlight is the stop codon.

2.2 ?PChyd基因序列生物信息學分析

PChyd的開放閱讀框（ORF）序列全長303 bp，編碼蛋白氨基酸序列全長100?aa（圖3、圖4），分子量為10.58 kDa，pI為5.68。結構域分析顯示該蛋白包含信號肽區域和疏水蛋白功能區域。信號肽區域包含22?aa，疏水蛋白功能區域包含70?aa。利用MEGA 6.0軟件對PChyd基因構建系統發育樹（圖5），結果顯示真菌疏水蛋白hyd基因可分為小叢殼目（Glomerellales）和肉座菌目（Hypocreales）2個組，而肉座菌目（Hypocreales）

組疏水蛋白hyd基因又可分為3個亞組，分別包括肉座菌科（Hypocreaceae）、生赤殼科（Bionectri aceae）和蟲草菌科（Cordycipitaceae）。蟬擬青霉PChyd與其他蟲草菌科的真菌聚在一個分支上，與粗糙蟲草菌（Cordyceps confragosa）的親緣關系最近。將hyd基因系統發育樹中的蟲草菌科序列進行氨基酸序列比對（圖6），結果發現蟲草菌科的hyd基因保守度較高，完全保守的氨基酸有56個。

采用鄰接法并進行1000次重復構建系統發育樹;星號標記的為蟬擬青霉疏水蛋白。

Phylogenetic tree was constructed using neighbor-joining method， and percent bootstrap support from 1000 iterations;P. cicadaehydrophobin is?marked as star.

2.3 ?PChyd表達模式分析

利用qRT-PCR方法對PChyd基因在不同培養條件（PDA和CM）或不同發育階段（AP、BS和C）的表達模式進行檢測（圖7）。結果表明，PChyd基因在PDA、AP、BS中相對表達量分別為1.029±0.281、0.855±0.221、1.284±0.373。統計分析顯示，三者之間差異不顯著，但均顯著高于CM（0.056±0.005）和C（0.161±0.045）的相對表達量。其中在BS狀態下，PChyd基因表達量最高，表明該基因可能在蟬擬青霉附著胞（AP）和芽生孢子（BS）階段具有重要作用。

2.4 ?PChyd敲除載體的構建

以蟬擬青霉基因組DNA為模板，使用引物PC31/PC32和PC33/PC34分別對PChyd基因的左、右臂片段進行擴增，結果如圖8所示。通過PCR獲得了長度為1182?bp的左臂和長度為874?bp的右臂。經Overlop PCR后將左、右臂融

PDA：在PDA中生長的菌絲體;CM：在CM培養基中生長的菌絲體;AP：誘導的附著胞;BS：誘導的芽生孢子;C：分生孢子。不同小寫字母表示不同樣品之間差異顯著（P<0.05）。

PDA： Mycelium grown in PDA; CM： Mycelium grown in complete medium; AP： Induced appressorium; BS： Induced blastospore;C： Conidia. Different lowercase letters indicatesignificant differences at the 0.05 level.

合（片段大小為2008?bp），融合產物進行TA克隆構建pMD19-LR，TA克隆后的質粒經PmeI酶切處理和去磷酸化處理后，與HPH（1348?bp）進行T4連接，構建pMD19-hyd（載體理論大小為3356?bp），使用引物PC31/PC34進行菌落PCR驗證，結果如圖9所示。從左往右的第3、4、9泳道均能擴增出3500?bp左右的片段，該片段可能為插入HPH片段的敲除載體pMD19-hyd。經測序驗證，該片段大小為3356?bp，與設計載體大小一致，包括1158?bp左臂、1348?bpHPH和850?bp右臂。測序結果確認該片段測定序列與設計序列一致，證明已成功構建PChyd的敲除載體，可用于后續轉化實驗。

3 ?討論

在農業上，昆蟲病原真菌作為一種重要的微生物資源，相較于化學農藥更為安全環保，已廣泛應用于農林蟲害的生物防治^[19]。了解昆蟲病原真菌毒力相關基因及其致病機理，對于構建基因工程生防菌、提高防治效果和挖掘應用潛力極其重要。當前，白僵菌與綠僵菌毒力基因的研究已有大量報道，但有關蟬擬青霉致病機理、毒力相關基因研究尚未見報道。在前期研究中，本課題組對蟬擬青霉菌株（ZJ1611）基因組進行了測序。據已報道的白僵菌與綠僵菌的毒力基因特征，對蟬擬青霉毒力相關基因進行了篩選，共篩選出41類蛋白，共464個毒力相關基因。昆蟲病原真菌的侵染過程可以概述為4個階段：粘附階段、萌發和穿透階段、血腔中的繁育階段、菌絲穿出蟲體并產孢階段^[20]。根據毒力相關基因可能參與的昆蟲病原真菌侵染昆蟲的過程，前期篩選出3種可能參與粘附階段的基因，分別是疏水蛋白（hyd rophobin）基因、細胞壁蛋白（cell wall protein）基因和MAP激酶（mitogen-activated protein kinase）基因。本研究選取1個可能參與侵染初期的毒力相關基因——疏水蛋白基因進行深入研究。以蟬擬青霉為供試材料，對PChyd基因進行克隆，并對該基因的核苷酸序列和氨基酸序列進行生物信息學分析。結果發現，該基因編碼的蛋白屬于hydrophobin-2超家族，并且多重序列比對發現該基因與其他幾種蟲草菌科菌株的疏水蛋白氨基酸序列的保守度較高，功能結構域分析也發現該基因具有疏水蛋白典型的信號肽和疏水蛋白功能區域^[21-22]。這些結果都表明該基因屬于疏水蛋白基因。

疏水蛋白是一類由高等絲狀真菌在某一特定時期分泌產生的、具有特殊理化性質的小分子量（<20?kDa）蛋白質^[23]。在昆蟲病原真菌中，疏水蛋白參與了其對昆蟲的侵染過程，是昆蟲病原真菌重要的毒力相關基因^[24]。早期研究已在多個昆蟲病原真菌中發現了疏水蛋白基因。例如，在金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）、粉擬青霉（Paecilomyces farinosus）、球孢白僵菌（Beau veria bassiana）中，分別發現了疏水蛋白基因ssgA、pfah1、mHyd2^[25-27]。但這些報道未對疏水蛋白基因在昆蟲病原真菌致病機理方面進行闡述。隨著真菌基因敲除技術的逐步成熟，疏水蛋白在昆蟲侵染過程中的功能有了進一步研究。例如，通過對球孢白僵菌的疏水蛋白基因hyd1和hyd2敲除發現，突變菌株Δhyd1孢子疏水性降低，表面的碳水化合物表位和β-1，3-葡萄糖分布產生變化，毒力降低，但孢子粘附性未受影響。突變菌株Δhyd2孢子表面疏水性和粘附性均降低，但毒力不受影響。菌株Δhyd1、Δhyd2孢子的疏水性、粘附性和毒力均降低^[28]。在對棕色綠僵菌（Metar hizium brunneum）的3個疏水蛋白基因敲除后發現，3個突變菌株的產孢能力下降，且分生孢子和芽生孢子侵染甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）幼蟲的毒力下降。除突變體Δhyd3外，其余2個突變體疏水性不變^[29]。這些研究都表明，疏水蛋白基因在昆蟲病原真菌侵染昆蟲初期（第1階段）和芽生孢子（第2階段）中扮演著重要的角色。為分析蟬擬青霉疏水蛋白基因PChyd可能的功能，本研究對其在不同培養條件（PDA、CM）或不同發育階段（AP、BS、C）的表達情況進行了檢測，結果發現PChyd基因在AP（誘導的附著胞，侵染初期的侵染結構）、BS（誘導的芽生孢子，參與了昆蟲血腔中定殖過程）中都顯示了較高的表達量，與早期研究結果較一致。黃姍等^[30]研究發現，蟲生真菌萊氏野村菌hyd基因表達量隨著分生孢子的產生而升高，到產孢量達到最大的第8天時，表達量最高，之后隨著產孢量的下降，基因的表達量降低，推測該基因在萊氏野村菌分生孢子的形成過程中起著重要作用。而PChyd基因在C（分生孢子）中相對表達量較低，推測這種低水平的表達可能與靜息細胞的代謝活性降低有關。Junges等^[16]在金龜子綠僵菌（M. anisopliae）中也曾發現這種現象。

綜上所述，在前期研究的基礎上，本研究對蟬擬青霉疏水蛋白基因PChyd進行了克隆，對其序列進行了生物信息學分析，并分析了其在不同培養條件或不同發育階段的表達模式，推測其可能參與病原真菌的生長、粘附、定值侵染過程，同時成功構建了該基因的敲除載體，為進一步研究該基因的致病機理奠定了基礎，也為該菌的生防菌改造和應用提供了理論依據。

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