采后菠蘿黑心病發病過程中活性氧的代謝途徑

常金梅 何詠 張魯斌

摘 ?要：為了探討采后菠蘿黑心病發病過程中活性氧的代謝途徑，以‘巴厘菠蘿為材料，將其貯藏在25?℃條件下，觀察黑心病的發病情況，每隔3 d對整果果肉以及健康部位和患病部位的果肉組織進行取樣，測定果實發病率以及果肉褐變度，對發病過程中脂氧合酶（LOX）活性和丙二醛（MDA）含量進行了測定，同時對活性氧代謝起關鍵作用的抗壞血酸（AsA）、谷胱甘肽（GSH）、類黃酮含量以及活性氧清除相關酶（POD、CAT、SOD）活性進行了測定。結果表明，菠蘿果實在貯藏第6天開始發病，到15 d時，發病率為100%，褐變度在第6～9天時增長最快;在黑心病發病過程中，與健康部位相比，患病組織伴隨著LOX活性的升高，MDA的積累，同時出現AsA的下降、類黃酮含量的顯著增加，且患病組織POD、CAT酶活性快速下降，但谷胱甘肽含量和SOD酶活性幾乎沒有變化。由此可推斷，在采后菠蘿黑心病發病過程中，AsA、類黃酮、POD、CAT在活性氧代謝中起關鍵作用。

關鍵詞：菠蘿;黑心病;活性氧代謝中圖分類號：S668.3??????文獻標識碼：A

Metabolism of Reactive Oxygen Species During Development of Black Heart Disease in Post-harvest Pineapple

CHANG Jinmei^1，2，3， HE Yong¹， ZHANG Lubin^1，2，3*

1. Lingnan Normal University， Zhanjiang， Guangdong 524091， China; 2. South Subtropical Crops Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences?/?Key Laboratory of Hainan Province for Postharvest Physiology and Technology of Tropical Horticultural Products， Zhanjiang， Guangdong 524091， China; 3. Jiaying University / Guangdong Provincial Key Laboratory of Conservation and Precision Utilization of Characteristic Agricultural Resources in Mountainous Areas， Meizhou， Guangdong 514000， China

Abstract： In order to explore the metabolism pathway of reactive oxygen species （ROS） related to the development of black heart disease in postharvest pineapple， ‘Paris pineapple as the material was stored at room temperature and observed for the incidence of black heart disease. The pulp along the equator and the pulp of healthy and diseased parts were sampled separately every 3 days. The incidence of black heart disease and the browning degree of pulp were tested. At the same time， the activities of lipoxygenase （LOX）， and the key enzymes of ROS metabolism （POD， CAT， SOD）， and the contents of malondialdehyde （MDA）， ascorbic acid （AsA）， flavonoids and glutathione （GSH） were tested during the course of the storage. The results showed that the black heart disease of pineapple appeared at the 6th day and the incidence rate increased to 100% at the 15th day. From the 6th day to the 9th day， the browning was the fastest. Compared with healthy parts， the diseased tissue was accompanied by increase of LOX activity and MDA accumulation， significant decrease in AsA content and POD， CAT activities， and rapid increase in flavonoid content. The glutathione content and SOD activity did not change significantly. It could be inferred that AsA， flavonoids， POD and CAT play key roles in ROS metabolism during the development of black heart disease in post-harvest pineapple.

Keywords： pineapple; black heart disease; metabolism of reactive oxygen

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.07.020

菠蘿[Ananas comosus（L.）Merr]是我國南方的特色水果，也是我國熱區主要經濟作物。其種植效益和出口貿易情況直接關系到熱區農民的經濟收入^[1]。采后菠蘿主要以鮮果形式在國內市場銷售，但采后果實貯藏和運輸過程中容易發生黑心病，特別是我國主栽品種‘巴厘，其貨架期僅為3～5?d^[2]，之后果肉均出現不同程度的褐色或黑褐色病變，嚴重影響菠蘿產業和進出口貿易發展。菠蘿黑心病表現為菠蘿外部無任何癥狀，橫剖后果心周圍果肉褐變，通常是小果先出現半透明的水漬狀或淺褐色的小斑點，隨著發病程度的加深，褐色斑點互相聯結成一片，并向果髓發展，最終果髓甚至果肉都變為黑褐色^[3-5]。嚴重影響果實的品質，使果實喪失商品價值，對菠蘿產業的發展造成極大的危害^[6-7]。

正常情況下，植物體內活性氧（ROS）的產生和清除保持動態平衡，植物在受到外界非生物逆境脅迫時，會造成細胞代謝的紊亂，誘導產生過量的ROS，引起細胞的氧化傷害，進而破壞細胞正常結構，致使植物體內的生物膜脂過氧化、DNA受損等多種毒害效應發生，最終導致細胞死亡，植物表現出局部壞死、褐變等癥狀^[8-11]。而植物體內存在一套清除活性氧、防止其毒害的保護體系，包括酶促和非酶促2類防御保護系統，酶促保護系統中的保護酶系主要由超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）等組成;非酶促即是抗氧化物質，主要包括抗壞血酸（AsA）、谷胱甘肽（GSH）、類黃酮等^[12-13]。本研究主要針對采后菠蘿黑心病發病過程中防御活性氧毒害的保護系統進行了研究，旨在明確黑心病發病過程中起關鍵作用的活性氧代謝途徑，為明確菠蘿黑心病發生的生理機制奠定基礎。

1??材料與方法

1.1 ?材料

品種為‘巴厘（Ananas comosus‘Comte de Paris），從田間采收七八成熟、大小均勻、無機械損傷的‘巴厘果實，保留頂芽，保留果柄長度1?cm，作為供試材料。將準備好的菠蘿置于塑料籃中，用聚乙烯袋包裹塑料籃（不完全密封），在常溫（25?℃）下貯藏，及時觀察黑心病的發病情況并取樣。

1.2 方法

1.2.1 ?取樣方法??每個處理隨機取5個菠蘿，橫切果實赤道部果肉，厚度約1?cm，去果皮，切小塊，液氮速凍，用高速粉碎機碾成粉末狀，做標記后于?80?℃保存;病健部分開取樣時，健康部位指赤道部位距果皮0.5?cm果肉，發病部位指果梗與果肉交接處。每處理重復3次。

1.2.2 ?褐變度和發病率的測定??參照張墨英等^[14]的方法加以改進：稱取樣品1?g，加入10?mL 95%乙醇，4000?r/min下離心15?min，取上清液在420?nm下測吸光度值，重復3次。發病率測定：每隔3?d測定一次，每次取貯藏菠蘿30個切開觀察是否發病，發病率=發病果數/菠蘿總數×100%。

1.2.3??脂氧合酶活性測定 ?粗酶液提取：參考陳昆松等^[15]的方法并有所改進，取樣品2?g，加入10?mL預冷的pH?7.0，0.05?mol/L的磷酸緩沖液，4?℃，15?000?r/min離心15?min，取上清液備用。脂氧化酶（LOX）活性測定：先配制反應底物，在100 mg亞油酸鈉中加入等質量的TritonX-100及4?mL無氧水，避免產生氣泡，用0.5?mol/L NaOH溶液滴定至溶液澄清，定容25?mL，保存于?18?℃，取反應底物25?μL，加緩沖液2.775?mL，加粗酶液0.2?mL，混勻后于234?nm處測吸光度值，記錄1?min內吸光度值的變化。以每分鐘每克組織鮮重引起A₂₃₄的變化為一個酶活單位（A?/min FW），重復3次。

1.2.4 ?丙二醛含量測定??參照文獻[16]的方法進行測定。測定丙二醛（MDA）與硫代巴比妥酸（TBA）反應后的OD₅₃₂、OD₆₀₀和OD₄₅₀，按公式C=6.45?（OD₅₃₂?OD₆₀₀）?0.56OD₄₅₀計算MDA（μmol/g）的含量。

1.2.5 ?抗壞血酸、類黃酮和谷胱甘肽含量的測定??參照賈君^[17]2，6-二氯靛酚的測定方法，取樣品1?g，加入40?mL 20?g/L的草酸，搖勻，靜置10?min，在冰上過濾，取濾液備用。用已知濃度的標準AsA滴定2，6-二氯靛酚，計算出1?mL 2，6-二氯靛酚相當于AsA的質量，然后取10?mL濾液，用已標定的2，6-二氯靛酚進行滴定，計算出AsA含量，重復3次，單位mg/100?g。類黃酮的含量測定參考張雪輝等^[18]的方法略加修改，取樣品2?g加入25?mL甲醇，超聲45?min，過濾，取濾液備用。以不同濃度的蘆丁標準品溶液做標準曲線，取濾液2.5?mL，加入0.5?mL NaOH，放置5?min，甲醇定容至10?mL，搖勻后在416?nm下測吸光度值，重復3次，單位mg/g。GSH的測定參考翟文慧等^[19]的紫外-可見分光光度法，取1?g樣品加入10?mL 0.1?mol/L的NaOH溶液，超聲10?min，定容至25?mL，混勻，過濾，留濾液備用。以不同濃度的GSH標準品溶液繪制標準曲線，取1?mL濾液用0.1?mol/L的NaOH溶液定容至10?mL，在230?nm處測定吸光度值，重復3次，單位mg/g。

植物體內存在酶促和非酶促2類防御活性氧毒害的保護系統，其中非酶促保護系統中AsA作為植物體內重要的抗氧化劑，充當抗氧化防御系統中的電子供體，參與催化細胞清除OH^-、O₂^-、H₂O₂等活性氧自由基，抵御自由基對細胞的傷害，同時保護果實內的其他抗氧化成分^[22-26]。類黃酮和GSH均有清除植物體內的自由基及活性氧，保護細胞膜的結構和功能的完整性，增強植物的抗逆性^[27]。本研究結果表明，在0～3?d時，AsA含量較高，黑心病未發生，可能是由于AsA減輕膜的受損傷程度，從第6天開始，AsA含量快速下降，黑心病出現。菠蘿果實在患病前后類黃酮含量變化波動比較大，患病之前類黃酮含量保持穩定，患病后受逆境刺激，其含量迅速升高，以清除體內自由基，保護細胞結構和功能的完整性，之后隨著褐化的加重，自身生理機能遭到破壞，類黃酮含量下降。而GSH在整個發病過程中基本沒有波動，且患病部位和健康部位無差異。酶促保護系統中SOD、CAT和POD為清除活性氧的主要酶，SOD能催化體內過量的O₂^-生成H₂O₂，而CAT和POD催化H₂O₂還原成H₂O^[28]。本研究結果顯示，POD、CAT在黑心病發病前后均出現了較大的波動，且患病組織與健康組織的酶活性均出現了較大的差異，推測POD、CAT在病害發生時均作出了響應，而SOD活性在患病部位和健康部位基本沒有變化，由此可知，在菠蘿黑心病發病過程中，防御活性氧毒害的非酶促保護系統中，AsA和類黃酮起到了關鍵作用，而酶促保護系統中，POD、CAT起關鍵作用。

參考文獻

• 劉海清， 劉志頤. 中國菠蘿鮮果產業的國際競爭力分析[J]. 江蘇農業科學， 2017， 45（17）： 334-337.
• 侯曉婉， 鹿志偉， 張魯斌， 等. 外源抗壞血酸對采后菠蘿黑心病發生及抗氧化性能的影響[J]. 果樹學報， 2018， 35（9）： 1105-1116.
• Selvarajah S， Bauchot A D， John P. Internal browning in coldstored pineapples is suppressed by a postharvest application of 1-methylcyclopropene[J]. Postharvest Biology and Technology， 2001， 23（2）： 167-170.
• 胡會剛， 孫光明， 董??晨， 等. 菠蘿采后主要病害發生及防治研究進展[J]. 廣東農業科學， 2012， 39（24）： 93-96.
• 李江明. 菠蘿果實采后黑心病的發生機理研究[D]. 湛江： 廣東海洋大學， 2014.
• Selvarajah S， Bauchot A D， John P. Internal browning in cold-stored pineapples is suppressed by a postharvest application of 1-methylcyclopropene[J]. Postharvest Biology and Technology， 2001， 23（2）： 167-170.
• Zhou Y， O'Hare T J， Jobin-Decor M. Transcriptional regulation of a pineapple polyphenol oxidase gene and its relationship to blackheart[J]. Plant Biotechnology Journal， 2003， 1（6）： 463-78. ?
• Veselin P， Jacques H， Bernd M R， et al. ROS-mediated abiotic stress-induced programmed cell death in plants [J]. Frontiers in Plant Science， 2015， 6（69）： 69.
• Aaron B， Ron M， Nobuhiro S. ROS as key players in plant stress signalling[J]. Journal of Experimental Botany， 2014， 65（5）： 1229-1240.
• Nasser S， Kemal K， Peer M， et al. Global plant stress signaling： reactive oxygen species at the cross-road[J]. Frontiers in Plant Science， 2016， 7（187）： 187.
• Mirza H， Kamrun N， MD M A， et al. Exogenous nitric oxide pretreatment protects Brassica napus?L. seedlings from paraquat toxicity through the modulation of antioxidant defense and glyoxalase systems[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2018（126）： 173-186.
• 裴冬麗， 馬原松， 李成偉. 番茄與白粉病菌互作反應中活性氧的積累[J]. 植物保護學報， 2010， 37（01）： 91-92.
• Monacm. Active oxygen species in plant defense against pathogens[J]. Plant Physiology， 1994， 105（2）： 467-472.
• 張墨英， 滕玉萍.草莓酚類和褐變度的研究[J]. 食品科學， 1992（9）： 9-13.
• 陳昆松， 徐昌杰， 許文平， 等. 獼猴桃和桃果實脂氧合酶活性測定方法的建立[J].果樹學報， 2003（6）： 436-438.
• 陳建勛. 植物生理學實驗指導[M]. 廣州： 華南理工大學出版社， 2006.
• 賈??君.5種水果中維生素C含量的測定研究[J].冷飲與速凍食品工業， 2004，?（2）： 33-34.
• 張雪輝， 趙元芬， 陳建民. 甘草中總黃酮的含量測定[J]. 中國中藥雜志， 2001， 26（11）： 746-747.
• 翟文慧， 王愛月. 紫外分光光度法測定保健食品中谷胱甘肽[J]. 預防醫學論壇， 2005（5）： 560-561.
• Stephane A. Comparison of spray-drying drun-drying and freeze-drying for β-carotene encapsulation and preservation[J]. Food Science， 1997， 62（6）： 1158-1162.
• 艾文婷， 張??敏， 郝??爽， 等. 熱激溫度對采后黃瓜冷害及活性氧代謝的影響[J]. 河南農業大學學報， 2019， 53（2）： 244-250.
• Mahmood Q， Ahmad R， Kwak S S，?et al. Ascorbate and glutathione： protectors of plants in oxidative stress[M]. Dordrecht： Springer， 2010： 209-229.
• 劉鍇棟， 敬國興， 袁長春， 等. 外源抗壞血酸對圣女果采后生理和抗氧化活性的影響[J]. 熱帶作物學報， 2012， 33（10）： 1851-1855.
• Liu K D， Yuan C C， Chen Y， et al. Combined effects of ascorbic acid and chitosan on the quality maintenance and shelflife of plums[J]. Scientia Horticulturae， 2014， 176： 45-53.
• 孫寧靜， 范靈姣， 唐志鵬， 等. 外源抗壞血酸對牛心柿的保鮮效應研究[J]. 園藝學報， 2014， 41（增刊）： 2634.
• 鄭小林， 陳??燕， 敬國興， 等. 草酸處理對杧果采后果實AsA-GSH循環系統的影響[J]. 園藝學報， 2011， 38（9）： 1633-1640.
• 張志國， 陳錦屏， 邵秀芝， 等. 紅棗核類黃酮清除DPPH自由基活性研究[J]. 食品科學， 2007（2）： 67-70.
• 柳??鳳， 歐雄常， 詹儒林， 等. Fusarium mangiferae對杧果頂芽內活性氧代謝的影響[J]. 果樹學報， 2015， 32（1）： 94-99.